'

РАЗРАБОТКА ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОГО И ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО СПОСОБОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИФЕНОЛОВ И КОФЕИНА В РАЗЛИЧНЫХ СОРТАХ ЗЕЛЕНОГО И ЧЕРНОГО ЧАЯ

Понравилась презентация – покажи это...





Слайд 0

РАЗРАБОТКА ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОГО И ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО СПОСОБОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИФЕНОЛОВ И КОФЕИНА В РАЗЛИЧНЫХ СОРТАХ ЗЕЛЕНОГО И ЧЕРНОГО ЧАЯ 2007 Алексеева Анна Владимировна Научные руководители: проф., д.х.н. Карцова А. А., асп. Ганжа О. В.


Слайд 1

Важнейшие биологически активные компоненты чая 1


Слайд 2

Методы анализа реальных объектов, содержащих полифенольные соединения Определение общего содержания полифенолов УФ Анализ катехинов, алкалоидов ЭХ Анализ полифенолов, аминокислот, сахаров, витаминов, органических кислот МС Анализ теафлавинов гликозидов, витаминов Фл Анализ полифенолов в биологических жидкостях человека КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ 2


Слайд 3

J. of Chromatogr. А, Talanta, Analytica Chimica Acta. 2005-2006 гг Всего: 17 статей 3


Слайд 4

4 МЕТОД КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА


Слайд 5

Поставленные задачи: Получение спектрофотометрических характеристик полифенолов и кофеина Оптимизация условий разделения модельной смеси полифенолов в режиме капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) Выяснение возможностей мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ) для одновременного разделения полифенолов и кофеина. Установление факторов, влияющих на селективность и эффективность разделения в этом режиме Количественный анализ реальных объектов и получение характеристических профилей Использование метода ОФ ВЭЖХ с УФ-детектированием как референтного для решения этой задачи 5


Слайд 6

Оптимизация условий детектирования В качестве рабочей была выбрана длина волны детектирования 200 нм 6 Условия: спектрофотометр Shimadzu UV-1700; длина оптического пути = 1 см; концентрации водных растворов Caf, EC, EGCG – 2•10-5 М


Слайд 7

Электрофореграмма модельной смеси катехинов в КЗЭ КАПЕЛЬ 105, Капилляр: Lобщ = 60 см, Lэфф =50 см, dвнутр=75 мкм. Длина волны: ? = 200 нм Буферный электролит: 12,5 мМ тетрабората натрия (pH 9.2), 8 мМ ?-циклодекстрина Проба: Cat, EC – по 10 мг/л, EGC, ECG, GCG, EGCG – по 20 мг/л Ввод: 30 мбар, 10 сек Напряжение: 20 кВ 7 pKa: 8.64, 9.41, 11.26, 13.26


Слайд 8

Вариант мицеллярной электрокинетической хроматографии N –компоненты пробы, взаимодействующие с мицеллами Мицеллы и ЭОП движутся в противоположных направлениях. Компоненты пробы распределяются между фазой раствора и мицеллярной фазой, при этом константа распределения специфична для каждого сорта молекул пробы. C12H25OSO3- Na+ Додецилсульфат натрия ККМ = 8,3 мМ 8


Слайд 9

Зависимость электрофоретических подвижностей аналитов от концентрации детергента в буферном электролите где Lобщ – общая длина капилляра, см Lэфф – эффективная длина капилляра, см U – величина рабочего напряжения, В tмигр – время миграции компонента, с 9


Слайд 10

Зависимость коэффициента разрешения от концентрации детергента в буферном электролите где t1и t2 – времена миграции первого и второго компонента, соответственно, мин w10,5 и w20,5 – ширина пиков на полувысоте, мин 10


Слайд 11

Зависимость эффективности разделения от концентрации детергента в буферном электролите 11 где tR – времена миграции аналита, соответственно, мин W0,5 – ширина пика аналита на полувысоте, мин


Слайд 12

Электрофореграмма модельной смеси катехинов, галловой кислоты и кофеина в МЭКХ Ведущий электролит: 25 мМ фосфатный буфер pH 7,0, 25 мМ додецилсульфата натрия Проба: смесь стандартов:C, EC – по 25мг/л, Caf – 12,5 мг/л, EGC, ECG, GCG, EGCG, GA – по 50 мг/л Ввод: 30 мбар, 10 сек. Напряжение: 25 кВ. Длина волны: ? = 200 нм 12


Слайд 13

Характеристические профили образцов чая 1 – Caf, 2 – EGC, 3 – EGCG, 4 – EC, 5 – GA, 6 – ECG 13 Экстракт зеленого чая Экстракт белого чая Экстракт черного чая 45 mAU 45 mAU 45 mAU


Слайд 14

14 ПО 1 мкг/мл P = 0.95, n = 5 Количественный анализ различных сортов чая


Слайд 15

15 Взаимодействие полифенолов с органическими и неорганическими соединениями


Слайд 16

16 Изменение концентрации свободной формы EGCG от мольного соотношения белок/полифенол


Слайд 17

1 2 3 1 – казеин (5 мг/л) 2 – EGCG (3 мг/л) 3 – модельная смесь EGCG (3 мг/л) и казеина (20 мг/л) 17 Электронные спектры поглощения эпигаллокатехин галлата, казеина и их комплекса Условия: спектрофотометр Shimadzu UV-1700; длина оптического пути = 1 см; концентрации водных растворов Caf, EC, EGCG – 2•10-5 М


Слайд 18

18 5 % молока 5 % молока Зеленый чай Черный чай Влияние добавки молока в чай на его электрофоретический профиль 1 – Caf, 2 – EGC, 3 – EGCG, 4 – EC, 5 – GA, 6 – ECG


Слайд 19

19 Влияние добавки в чай молока на содержание полифенолов P = 0.95, n = 5


Слайд 20

20 Изменение электрофоретического профиля чая при добавлении соли железа (III)


Слайд 21

21 Изменение площади пика EGCG на электрофореграмме при добавлении в пробу соли железа (III)


Слайд 22

Зависимость Rf аналитов от концентрации метанола в составе подвижной фазе 22 Rf = a/b Rh = Rf ·100 Пластины «Sorbfil» ПТСХ-АФ-В-УФ (ООО «Имид», г. Краснодар) П.ф. метанол - этилацетат ПО (Caf) 100 нг


Слайд 23

23 Влияние состава элюента на селективность разделение кофеина и эпикатехина При содержании метанола 10% Rf (Caf) = 0,17 Оптимальный состав элюента: метанол – этилацетат = 25 : 75 % об.


Слайд 24

(1 – 7) – стандартные растворы кофеина, 8 – проба чая, 9 – проба чая с добавкой хлорида железа (III) Влияние добавки соли железа (III) на хроматографический профиль реального объекта 24 Условия:Пластины ПТСХ-АФ-В-УФ «Сорбфил», п.ф. - CH3OH : CH3COOC2H5 = 1 : 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Линия фронта растворителя Линия старта


Слайд 25

Колонка: Supelco C18; 150 ?4 мм Элюент: ацетонитрил – 1 % муравьиная кислота 25 Проверка корректности результатов количественного определения полифенолов и кофеина, полученных в режиме КЭ


Слайд 26

Варианты изократического и градиентного элюирования в режиме ОФ ВЭЖХ 26 Элюент А – ацетонитрил Элюент В – 1% муравьиная кислота


Слайд 27

Оптимальные условия разделения модельной смеси кофеина и полифенолов в режиме ВЭЖХ Линейный градиент элюирования: 0.0 мин – 15% элюента А 15.0 мин – 5 % элюента А Элюент А – CH3CN Элюент В – 1% HCOOH 27 Колонка: Supelco С18; 150 x 4 мм Детектирование: 254 нм ПО (Caf, GA) 1 мкг/мл ПО (EGC,EGCG) 10 мкг/мл


Слайд 28

28 Caf GA EGCG (P = 0.95, n = 3) Использование метода ВЭЖХ в качестве референтного


Слайд 29

Сопоставление с литературными данными 29 Концентрация выражена в % масс [1] P.L. Fernandez, M.J. Martin, etc. The Analyst. 2000. V. 125. P.421-425. [2] B.-L. Lee, C.-N. Ong. J. Chromatogr. A. 2000. V. 881. P.439-447.


Слайд 30

Выводы 1. Изучены возможности различных вариантов капиллярного электрофореза с УФ-детектированием (КЗЭ и МЭКХ) для одновременного разделения смеси полифенолов и кофеина. Показано, что использование мицеллярного режима позволяет проводить их количественное определение с пределом обнаружения 1 мкг/мл. В качестве референтного использовался метод ОФ ВЭЖХ 2. Установлены зависимости электрофоретических подвижностей, эффективности и селективности разделения аналитов от концентрации мицеллообразующего агента – додецилсульфата натрия. Найдена оптимальная концентрация детергента - 25 мМ 3. В режиме МЭКХ (буферный электролит: 25 мМ фосфатный буфер (pH 7.0), 25 мМ ДДСН; 25 кВ; 200 нм) получены характеристические профили и проведен количественный анализ реальных объектов – различных сортов зеленого и черного чая. 4. Показано, что процессы комплексообразования полифенолов чая с казеином и ионами Fe3+ приводит к заметному снижению содержания полифенольных соединений. 5. Предложен экспресс-вариант определения кофеина в составе чая методом ВЭТСХ с пределом обнаружения 100 нг


Слайд 31

Спасибо за внимание!


Слайд 32

Схема биосинтеза полифенолов Нарингенин (Ar = п-гидроксифенил)


Слайд 33

Ауреузидин (ауроны) Флоретин (дигидрохалконы) Бутеин (халконы) Катехин (флаван-3-олы) Лейкофизетинидин (флаван-3,4-диолы) Нарингенин (флаваноны) Кверцетин (флавон-3-олы) Дельфинидин (антоцианидины) Таксифолин (флаванонолы) Типичные представители флавоноидов


Слайд 34

Типичные представители нефлавоноидов п-Кумаровая кислота (R = H) Галловая кислота Ресвератрол Кофейная кислота (R = OH)


Слайд 35

Полифенолы Сложные эфиры Простые эфиры (-)-Эпигаллокатехин галлат Нарингенин-7-глюкозид


Слайд 36

Компоненты чая Фенольные вещества (до 30 %) Эфирные масла (0,02%) Алкалоиды (1-5 %) Аминокислоты и белки (16-25 %) Пектиновые вещества (2-6%) Пигменты (1-12 %) Минеральные вещества Витамины


Слайд 37

Среднее содержание флаван-3-олов в побеге цейлонского чая


Слайд 38

п-Кумаровая кислота (R = H) Кофейная кислота (R = OH) Ресвератрол Желтый солнечный закат (Е110) Красный очаровательный (Е129) Важные соединения, содержащие фенольные гидроксилы Полифенолы нефлавоноидной группы Синтетические пищевые красители


Слайд 39

[О] – ферменты, радикалы, катионы металлов Окисление полифенолов


Слайд 40

Потенциалы окисления катехинов


Слайд 41

Катехин Дегидродикатехин Окисление катехина ферментом пероксидазой в растительных объектах


Слайд 42


Слайд 43

Определение общей антиоксидантной активности зеленого чая


Слайд 44

pKa: 9.98 pKa: 8.64, 9.41, 11.26, 13.26 pKa: 8.72, 9.49, 11.23, 13.40 pKa: 4,27, 8,68, 11,45 pKa: 4,62 , 9,07


Слайд 45


Слайд 46

Предполагаемые структуры комплексов полифенол – Fe3+ ?


Слайд 47

Строение комплекса EGCG – Fe3+


Слайд 48

Зависимость селективности разделения аналитов от концентрации ДДСН в буферном электролите


Слайд 49

EGCG Caf 306 nm 209 nm 273 nm 206 nm УФ-спектры анионов эпигаллокатехин галлата и кофеина Условия: растворы EGCG (400 мкг/л) и Caf (1 мг/л) в 10 mM боратном буфере pH 9,2 Спектрофотометр UV-1700 «Shimadzu»


Слайд 50

4-диметиламиноцинамальдегида (ДМАЦА) Спектрофотометрическое определение полифенолов


Слайд 51

Преимущества ВЭТСХ Экспрессность Возможность параллельно проводить анализ нескольких образцов Легкость смены элюента Высокая эффективность


Слайд 52

Сравнение ТСХ и ВЭТСХ 27


Слайд 53

t0 – время выхода нейтральных сильно полярных соединений tR – время выхода соединений с промежуточной гидрофобностью tm – время выхода сильно гидрофобных соединений Механизм разделения в МЭХК


Слайд 54

H. Tsuchiya, M. Sato, H. Kato, H. Kureshiro, N. Tagahi // Talanta. 2005. V. 46. P.717-726.


Слайд 55

Влияние потребления кипяченой воды, свежезаваренного чая и свежезаваренного чая, содержащего 10% молока, на кровоток, обусловленный расширением сосудов (flow-mediated dilation (FMD)) 16


Слайд 56

Влияние катехинов на свойства растворов ДНК Дозовая зависимость характеристической вязкости ДНК при УФ-облучении в отсутствии (1) и в присутствии (2) (+)-катехина в растворе Спектры поглощения ДНК (1), (+)-катехина (2) и их смеси (3) Точками показана сумма спектров (1) и (2)


Слайд 57

Определение кофеина в реальных объектах


Слайд 58

Казеин Пролин


Слайд 59

?s1-Казеин ?-Казеин


Слайд 60

Серинфосфат Trp Leu Val Ser Pro


Слайд 61

Казеин в форме мицелл


Слайд 62

Казеин 150 мг/л EGCG 20 мг/л Казеин (150 мг/л) + EGCG (20 мг/л)


Слайд 63

(+)-катехин [2R,3S]-2-[3,4-дигидроксифенил]-3,4-дигидро-1[2H]-бензопиран-3,5,7-триол (-)-Эпикатехин [2R,3R]-2-[3,4-дигидроксифенил]-3,4-дигидро-1[2H]-бензопиран-3,5,7-триол (-)-эпигаллокатехин [2R,3R]-2-[3,4,5-тригидроксифенил]-3,4-дигидро-1[2H]-бензопиран-3,5,7-триол (-)-Эпикатехин галлат [2R,3R]-2-[3,4-дигидроксифенил]-3,4-дигидро-1[2H]-бензопиран-3,5,7-триол 3-[3,4,5-тригидроксибензоат (-)-эпигаллокатехин галлат [2R,3R]-2-[3,4,5-тригидроксифенил]-3,4-дигидро-1[2H]-бензопиран-3,5,7-триол 3-[3,4,5-тригидроксибензоат (-)-галлокатехин галлат [2S,3R]-2-[3,4,5-тригидроксифенил]-3,4-дигидро-1[2H]-бензопиран-3,5,7-триол 3-[3,4,5-тригидроксибензоат


Слайд 64

Концентрация органических лигандов – 1•10-4 М. Концентрация ионов железа –1•10-4 М 1 – Резорцин, 2 - Пирокатехин Резорцин Пирокатехин


Слайд 65


Слайд 66

Оптимальные условия электрофоретического разделения смеси полифенолов и кофеина Система капиллярного электрофореза Капель-105; Капилляр: Lобщ = 60 см, Lэфф =50 см, dвнутр=75 мкм; Буферный электролит: 25 мМ фосфатный буфер pH 7.0, 25 мМ додецилсульфата натрия; Ввод: 30 мбар, 10 с; Напряжение: 25 кВ Рабочая температура - 20°С Длина волны: ? = 200 нм 13


Слайд 67

17 Факторы, влияющие на содержание полифенолов в чайном напитке Условия произрастания чая Условия хранения (температура, влажность) Время заваривания чая Взаимодействие полифенолов с органическими и неорганическими соединениями


Слайд 68

19 Казеин Влияние добавки казеина на электрофоретический профиль полифенолов Проба: EGCG (20 мг/л) Проба: смесь EGCG (20 мг/л) и казеина (6 мг/л)


Слайд 69

Адсорбционная ТСХ Caf EC EGCG ECG Caf Реальный объект H = 0,02 мм ?(Caf/EC) = 0,68 Rs (Caf/EC) = 3,3 Rf=a/b – параметр удерживания аналита N=16·(a/w)2 - число теоретических тарелок на разделяющем участке Н=a/N – высота, эквивалентная теоретической тарелке ?=a1/a2 – коэффициент селективности двух аналитов (1-й аналит – более удерживаемый) Rs = 2?(a2-a1)/(w1+w2) – коэффициент разрешения двух аналитов (1-й аналит – более удерживаемый) a1, а2 - пути, пройденные аналитами b – путь, пройденный элюентом от линии старта до линии фронта w1, w2 – ширина пятна аналитов 29 Условия: Пластины ПТСХ-АФ-В-УФ «Сорбфил» п.ф. - CH3OH : CH3COOC2H5 = 1 : 3


Слайд 70

Содержание кофеина в чае «Кольца Джейд» (Китай) P = 0.95, n = 3 Условия: Пластины ПТСХ-АФ-А-УФ «Сорбфил» п.ф. - CH3OH : CH3COOC2H5 = 1 : 3 Объем пробы чая - 4 мкл Количественное определение кофеина в чае методом ВЭТСХ 31


×

HTML:





Ссылка: