'

Электронный Парамагнитный Резонанс и его применение в медико-биологических исследованиях

Понравилась презентация – покажи это...





Слайд 0

Российский Государственный Медицинский Университет Кафедра биофизики Электронный Парамагнитный Резонанс и его применение в медико-биологических исследованиях А. Н. Осипов, Ю.А. Владимиров


Слайд 1

Часть 1. Основы метода ЭПР Электронный Парамагнитный Резонанс


Слайд 2

Электронный парамагнитный резонанс Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР, EPR, ESR) - один из основных прямых методов обнаружения и идентификации (изучения строения) свободных радикалов и комплексов металлов переменной валентности, имеющих неспаренный электрон на молекулярной орбитали. В основе метода лежит резонансное поглощение электромагнитного излучения неспаренными электронами, помещенными в магнитное поле. Электрон в атоме участвует в двух видах движения: 1. Орбитальном (l) - вокруг ядра атома и 2. Спиновом (s) - вокруг собственной оси. Каждый вид движения можно охарактеризовать двумя моментами: 1. Механическим (P), отражающим движение материальной частицы и 2. Магнитным (m), отражающим движение заряженной частицы. Атом водорода


Слайд 3

Взаимосвязь механического и магнитного моментов Из классической механики известно, что момент количества движения электрона на круговой орбите радиуса R P=mvR, где m - масса электрона, а v - его скорость. Движение заряженной частицы по такому же контуру, создает магнитный момент, подобный тому, что возникает при движении тока m=IS, где I - сила тока в контуре (I=ve/2pR), а S - площадь контура (S=pR2) или m=veR/2 или, учитывая (P=mvR) m=-eP/2m (или m/P=-e/2m) Из квантовой механики известно, что P=nh/2p, где n - главное квантовое число. Тогда при n=1 получим m=-eh/4pm=b (магнетон Бора)


Слайд 4

Суммарный магнитный момент Таким образом, для орбитального движения ml/Pl=-e/2m Для спинового движения ms/Ps=-e/m Суммарный магнитный момент равен: mj=ml+ms, А суммарный механический равен: Pj=Pl+Ps Однако mj/Pj?ml/Pl ? ms/Ps поэтому вводят коэффициент пропорциональности (g) mj/Pj=-g*e/2m, где g это g-фактор, т.е. коэффициент, показывающий вклад орбитального и спинового момента в суммарный момент. В конечном итоге, поскольку ml??ms, то mj?ms и mj?-g*e/2m*h/2p*S =-gbS


Слайд 5

Энергия электрона в магнитном поле равна E=m*H*cos(m,H), где m - суммарный магнитный момент электрона, H - напряженность магнитного поля, cos(m,H) - угол между векторами m и H (обычно = 1 или -1), тогда подставив значение m получим E=-gbSH, Где S - спиновое квантовое число = +1/2 или -1/2. В итоге E=±1/2gbH


Слайд 6

Ориентация электронных спинов в магнитном поле В отсутствие внешнего магнитного поля все механические и магнитные спиновые моменты электрона ориентированы случайным образом В присутствии внешнего магнитного поля они могут быть ориентированы только двумя способами: по полю или против поля. В отсутствие магнитного поля При включенном магнитном поле


Слайд 7

H E При наложении магнитного поля магнитные моменты электронов ориентируются по полю или против поля. Их энергии изменяются, а энергетический уровень расщепляется на два. H . E0 В отсутствие внешнего магнитного поля электроны ориентированы случайным образом и имеют практически одинаковую энергию (E0) Расщепление энергетических уровней в магнитном поле (эффект Зеемана) H=0


Слайд 8

H E -1/2 gbH Система, где электроны распределены между двумя энергетическими уровнями, может поглощать электромагнитное излучение. При определенных значениях величины энергии падающего кванта (hn) , будут происходить переходы электронов между уровнями. +1/2 gbH E = hn DE = gbH Поглощение будет происходить при условии равенства энергий поглощаемого кванта и энергии перехода между уровнями, т.е. когда hn = gbH Это выражение называется – основным уравнением резонанса Поглощение электромагнитных волн (явление ЭПР)


Слайд 9

Почему ЭПР можно наблюдать только у парамагнетиков? Разность между числом электронов (заселенностью) на двух разных энергетических уровнях в парамагнетиках определяется уравнением Больцмана: ns=? - число электронов c s=?. ns= -? - число электронов c s= -?. ns=? парамагнетик диамагнетик ns= -? ns=? ns= -?


Слайд 10

Метод был открыт Евгением Константиновичем Завойским в Казанском Университете в 1944 году. Он заметил, что монокристалл CuCl2, помещенный в постоянное магнитное поле поглощает радиоволны в микроволновом диапазоне. Пионерами применения ЭПР в биологических исследованиях были Л.А. Блюменфельд и А.Э. Калмансон, которые в 1958 с помощью метода ЭПР обнаружили свободные радикалы полученные под действием ионизирующего излучения на белки. История открытия явления ЭПР


Слайд 11

Усилитель Записывающее устройство Аттенюатор Микроволновой источник (клистрон) Микроволновой резонатор Детектор Образец Двойной Т-мост ЭПР спектрометр


Слайд 12

В Казанском ГУ


Слайд 13

Прибор Завойского для измерения ЯМР и ЭПР


Слайд 14

Прибор Завойского для измерения ЭПР


Слайд 15

Как получить сигнал ЭПР ? Поглощение электромагнитных волн в радиоспектрометре ЭПР можно определять двумя способами: 1 - При постоянном магнитном поле, мы можем изменять частоту излучения. Максимальное поглощение будет наблюдаться при резонансе, когда h? = g?H При этом ожидаемый спектр будет таким: 2 - По техническим причинам мы поступаем по другому: мы используем микроволновое излучение при постоянной частоте волн и изменяем магнитное поле.


Слайд 16

Что такое сигнал ЭПР ? ? = const H поглощение h? = g?H Кроме того, в результате усиления сигнала ЭПР (путем его модуляции) мы получаем не поглощение A, а - первую производную поглощения по полю dA/dH. dA/dH H h? = g?H


Слайд 17

Часть 2. Спектры ЭПР Электронный Парамагнитный Резонанс


Слайд 18

77 K 300 K УФ облученный цистеин Примеры сигналов ЭПР g=4,3 g=2,25 Нитрозильные комплексы g=2,03 g=1,94 Fe-S белки Цитохром P-450 Метгемоглобин Радикалы аскорбата Печень крысы при 77 K g=2,00


Слайд 19

Основные характеристики сигнала ЭПР 4) сверхтонкая структура


Слайд 20

Амплитуда сигнала ЭПР C = Cs(S / SS) Площадь S под линией поглощения прямо пропорциональна концентрации пара-магнитных частиц в измеряемом образце (C). где k - коэффициент зависящий от условий измерения. C = k*S dA/dH H H A Второй интеграл-это площадь (S) под кривой поглощения (т.е. это число) сигнал ЭПР кривая поглощения площадь под кривой поглощения Амплитуда сигнала ЭПР зависит от количества поглощающих частиц и пропорциональна площади под кривой поглощения, т.е. второму интегралу от сигнала ЭПР. Практически получить значения S нетрудно. Существенно труднее найти величину k. Поэтому на практике при вычислении С обычно пользуются сравнением площади измеряемого образца S (концентрацию которого надо найти) с площадью эталонного образца Se (концентрация Ce которого известна). А


Слайд 21

Ширина сигнала ЭПР где D t - время измерения и DE - неопределенность энергии системы. Ширина сигнала ЭПР определяется взаимодействием магнитных моментов электрона с окружением. Теоретически минимальная ширина линии следует из соотношения неопределенностей Гейзенберга: Рассматриваемый процесс - это поглощение электромагнитного кванта, такое, что D t может быть интерпретировано как время нахождения электрона на верхнем энергетическом уровне (время релаксации T ), а D E как энергия системы нашем случае = gbH, отсюда dA/dH


Слайд 22

Спин-решеточная релаксация (T1) обусловлена взаимодействием магнитного момента электрона с решеткой (т.е. средой в которой находятся парамагнитные частицы). Время релаксации Процесс релаксации характеризуется временем релаксации. Время релаксации (т.е. время нахождения электрона в состоянии с большей энергией) зависит от двух процессов: спин-решеточной и спин-спиновой релаксации. время релаксации Релаксация - процесс восстановления заселенности энергетических уровней после поглощения кванта электромагнитного излучения. Спин-спиновая релаксация (Т2) Обусловлена взаимодействием– с другими парамагнитными частицами (т.е. спинами)


Слайд 23

Большое T Малое DH Малое T Большое DH Комплексы металлов - T1=1 нс DH=10 мТ Свободные радикалы - T1=0,1 мс DH=100 мкТ Зависимость суммарного времени релаксации (Т) от Т1 и Т2 выражается формулой: Тогда выражение для ширины сигнала ЭПР будет выглядеть так:


Слайд 24

2. Взаимодействие спинового магнитного момента электрона с орбитальным магнитным моментом электрона приводит к уширению сигнала в результате анизотропии g-фактора 3. Взаимное превращение форм радикала вызывает динамическое уширение сигнала R1 R2 4. Соударение радикала с другим радикалом или парамагнитным ионом лежит в основе уширения за счет спинового обмена Механизмы уширения сигнала ЭПР : 1. Взаимодействие магнитных моментов двух парамагнитных частиц (радикалов или ионов) приводит к уширению по диполь-дипольному механизму


Слайд 25

g-фактор g-фактор сигнала ЭПР - это не только параметр, отражающий вклад орбитального и спинового моментов в суммарный магнитный момент, но и характеристика, показывающая положение сигнала ЭПР во всем диапазоне магнитного поля. g=4,3 g=2,25 g=1,94 Fe-S белки Цитохром P-450 Метгемоглобин Радикалы аскорбата g=2,00 увеличение H увеличение g Из основного уравнения резонанса следует, что при n=const Следовательно, при увеличении H происходит снижение g, и наоборот. Однако, величину Н нельзя считать характеристикой сигнала ЭПР, т.к. при изменении n резонанс будет происходить уже при других значениях Н. Величина g не изменяется при изменении Н (т.е. она инвариантна от метода измерения), и поэтому g-фактор - характеристика сигнала ЭПР.


Слайд 26

Сверхтонкое взаимодействие Взаимодействие магнитного момента неспаренного электрона с магнитным моментом ядра соседнего атома (например, H или N) называется сверхтонким взаимодействием и приводит к появлению сверхтонкой структуры сигнала ЭПР H H3C OH электрон протон Протон имеет магнитный момент который ориентирован во внешнем магнитном поле (Ho) в двух направлениях (вдоль и поперек поля) т.к. подобно электрону, имеет спиновое число S = ±1/2. протоны Магнитный момент протона создает магнитное поле (+Hp или –Hp, зависящее от ориентации протона), которое складывается с внешним магнитным полем (Н0). Отсюда следует, что суммарная величина поля, приложенного к неспаренному, электрону будет немного больше (H0 + Hp)(если спин протона=1/2) или немного меньше (H0 - Hp), чем в отсутствии протона (H0) (если спин протона=-1/2). В результате такого взаимодействия, сигнал ЭПР (который бы в отсутствии протона состоял из одной линии) будет состоять из двух линий Расстояние между линиями будет зависеть от величины магнитного поля создаваемого протоном в месте нахождения неспаренного электрона, которое в свою очередь зависит от расстояния между электроном и протоном


Слайд 27

Сверхтонкая структура Неспаренный электрон в радикале может быть расположен близко к двум протонам, как в радикале этанола (.CH2-CH2-OH) H HC OH H H электрон протон Магнитное поле вокруг неспаренного электрона теперь может иметь следующие значения: H0 + Hp1 + Hp2 = H0 + 2Hp H0 + Hp1 - Hp2 = H0 H0 – Hp1 + Hp2 = H0 H0 – Hp1 - Hp2 = H0 - 2Hp Как результат, сигнал ЭПР радикала расщепляется на 3 линии 2Hp 2Hp Состояние Н=Н0 реализуется двумя способами (а Н=Н0+2Нр или Н=Н0-2Нр только одним), следова-тельно вероятность этого состо-яния (и интенсивность сигнала) будут вдвое больше. Расстояние между линиями (в данном случае 2Нр) является основной характеристикой взаимодействия неспаренного электрона с магнитным ядром. Эта величина называется, также, константой сверхтонкого взаимодействия. В конечном итоге вместо одного сигнала будет три с соотношением интенсивностей 1:2:1


Слайд 28

Сверхтонкое взаимодействие (продолжение) N=O H3C СH электрон протон Атом азота имеет магнитный момент который ориентирован во внешнем магнитном поле (Ho) в трех направлениях (вдоль поля, против поля и «поперек» поля) имеет спиновое число S = ±1 и 0. Магнитный момент азота создает магнитное поле (+Hp или –Hp, и Н=0), которое складывается с внешним магнитным полем (Н0). H0+0 H0 - Hp H0 + Hp азот электрон Отсюда следует, что суммарная величина поля, приложенного к неспаренному, электрону будет немного больше (H0 + Hp)(если спин азота=1) или немного меньше (H0 - Hp), чем в отсутствии азота (H0) (если спин азота=-1), либо не изменяется, если спин =0. В результате такого взаимодействия, сигнал ЭПР (который бы в отсутствии протона состоял из одной линии) будет состоять из трех линий


Слайд 29

Часть 3. Практическое применение в медико-биологических исследованиях Электронный Парамагнитный Резонанс


Слайд 30

Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях: естественные сигналы ЭПР метод спиновых меток и зондов метод спиновых ловушек


Слайд 31

Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях: естественные сигналы ЭПР метод спиновых меток и зондов метод спиновых ловушек


Слайд 32

Если взглянуть на спектр ЭПР, например, печени крысы, то можно увидеть сигналы цитохрома Р-450, сигнал метгемоглобина и сигнал свободных радикалов, принадлежащий семихинонным радикалам аскорбиновой кислоты и флавинов. Благодаря коротким временам релаксации сигналы ЭПР металлопротеинов можно наблюдать только при низкой температуре, например, температуре жидкого азота (77 К). 100 Гс g=4,3 g=2,25 g=2,03 g=2,00 g=1,94 Fe-S белки цитохром Р-450 свободные радикалы Спектр ЭПР печени крысы


Слайд 33

Радикал аскорбата аскорбат радикал аскорбата дегидроаскорбат Сигнал ЭПР радикала аскорбата можно наблюдать непосредственно в крови или плазме. Добавление пероксидазы приводит к увеличению сигнала ЭПР и последуюему его исчезновению. Длитель-ность кинетики пропорци-ональна концентрации аскорбата в крови. + пероксидаза


Слайд 34

Спектр ЭПР облученного УФ светом цистеина Повысить концентрацию свободных радикалов, для избежания трудностей при их изучении, можно затормозив их гибель и повысив скорость их образования. Это можно сделать путем облучения (УФ или ионизирующей радиацией) биологических объектов находящихся при низкой температуре. Естественные сигналы ЭПР, наблюдаемые в биологических системах hn


Слайд 35

Сигналы ЭПР семихинонных или феноксильных радикалов семихинонный радикал убихинона Q10 феноксильный радикал a-токоферола семихинонный радикал a-токоферола


Слайд 36

Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях: естественные сигналы ЭПР метод спиновых меток и зондов метод спиновых ловушек


Слайд 37

Спектр ЭПР нитроксильных радикалов состоит, в простейшем случае, из трех линий равной интенсивности, благодаря взаимодействию неспаренного электрона с ядром атома азота, имеющим целочисленный спин, равный ±1 или 0. Формула и спектр ЭПР нитроксильного радикала 2,2,6,6-тетраметил-пиперидин-1-оксил (ТЕМПО). Метод спиновых зондов


Слайд 38

Время корреляции tc Если нитроксильный радикал находится в водном растворе, то его вращение является изотропным и достаточно быстрым. Это движение можно охарактеризовать временем корреляции (tс): При уменьшении скорости вращения проявляются анизотропные взаимодействия, которые приводят к уширению линий и соответственно изменению амплитуд компонент спектра, а затем и к сдвигу крайних компонент. 10 Gs Cпектр ЭПР ТЕМПО при разных tс где DH +1 - ширина низкопольной компаненты I+1 - амплитуда низкопольной компаненты I-1 - амплитуда высокопольной компаненты


Слайд 39

Используя уравнение Стокса-Эйнштейна можно определить значение вязкости в соответствующей макроскопической системе где R - эффективный радиус нитроксильного радикала. T – абсолютная температура t - время корреляции ? - вязкость Из уравнения видно, что используя нитроксильный радикал в качестве зонда, можно определить микровязкость среды, в которой находится радикал. В биологических исследованиях этот прием широко используется для измерения микровязкости биологических мембран. Время корреляции нитроксильного радикала непосредственно связано с микровязкостью среды


Слайд 40

Представленные спектры ЭПР отражают поведение зонда ТЕМПО в средах с различной гидрофобностью. Определив отношения a / (a + b) или (a / c) в этом спектре, можно посчитать параметр гидрофобности f, показывающий сколько и в какой фракции мембраны содержится зонда. Параметр f удобен при изучении процессов перекисного окисления в мембранах. a b c Параметр гидрофобности f


Слайд 41

Спектр ЭПР спинового зонда 5-доксил стеарата в мембране эритроцита При анизотропном вращении стеариновой кислоты вокруг длинной оси сигнал ЭПР будет сильно зависеть от степени анизотропии вращения, который количественно характкризуется так называемым параметром упорядоченности S Определить параметр упорядоченности S, можно измерив константы сверхтонкого расщепления – А|| и А+ и подставив их значения в формулу


Слайд 42

Параметр упорядоченности S равен 1, есливращение зонда происходит только вокруг нормали к плоскости мембраны. В «замороженных» мембранах, где липиды находятся в кристаллическом состоянии параметр упорядоченности S близок к 1. В «жидких» мембранах отклонение конуса вращения возрастает и S снижается, что вызывает изменения в спектре ЭПР. Параметр упорядоченности и вязкость мембраны


Слайд 43

Изменения сигнала ЭПР при уменьшении S и возрастании угла отклонения конуса вращения g


Слайд 44

Изменения сигнала ЭПР при удалении нитроксильного радикала от полярной карбоксильной группы жирной кислоты С-5 С-9 С-12 С-16


Слайд 45

Cпектр ЭПР рН чувствительного зонда (pK=4,7) при разных рН Казалось бы, что измерение рН достаточно легко и точно можно проводить с помощью рН-электродов, однако очень трудно если не невозможно измерить рН внутри лизосомы или фагоцитирующего лейкоцита. Для этих целей и применяют рН-чувствительные спиновые зонды. В основе метода рН-чувствительных зондов лежит способность зонда давать отличные друг от друга спектры ЭПР в протонированной и депротонированной формах. Таким образом, существует узкий диапазон рН в котором и происходит его протонирование и соответствующее изменение спектра ЭПР зонда.


Слайд 46

aN=(aNR + aNRH+)/2 Зависимость параметра f и aN от рН f =(IR)/(IR + IRH+) aNR и aNRH+ константы СТВ радикалов R и RH+ IR и IRH+ амплитуды сигналов ЭПРрадикалов R и RH+


Слайд 47

Спектр ЭПР нативного химотрипсина, помеченного спиновой меткой. I1 I0 Денатурация белка приводит к увеличению подвижности полипептидных цепей и соответственно увеличению подвижности спиновой метки. Соотношение величин I0 и I1 используется для количественной характеристики подвижности спиновой метки. Спектр ЭПР химотрипсина с присоединенной спиновой меткой


Слайд 48

В основе метода спиновых меток лежит тот же принцип изменения спектра ЭПР нитроксильного радикала в зависимости от скорости и изотропности его вращения. Отличием же метода является тот факт, что спиновая метка ковалентно связывается с другой более или менее крупной молекулой или макромолекулой. 3. Глубинный участок Белок 1. Водная фаза 2. Поверхностный слой Спектры ЭПР спиновой метки при взаимодействии с SH-группами белка


Слайд 49

Аллостерические эффекты в гемоглобине, меченым иминоксольным радикалом в геминовой группе при 25C. a - спектры ЭПР, b - путь включения метки в a-цепи гемоглобина и присоединение О2 к геминовой группе в b-цепях. R - spin labels. Сигнал ЭПР спиновой метки в гемоглобине


Слайд 50

Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях: естественные сигналы ЭПР метод спиновых меток и зондов метод спиновых ловушек


Слайд 51

Основы метода спиновых ловушек (spin trapping assay) Концентрация свободных радикалов в клетках и тканях не превышает 10 нМ. Минимальная концентрация свободных радикалов, которую можно обнаружить методом ЭПР 100 нМ R• + ST ? SA• Предложен в 1965-67 независимо Konaka T. (Япония), R. Lagercranz (Швеция) и E. Janzen (Канада).


Слайд 52

Характеристики спектра ЭПР спиновых аддуктов a-фенил-N-трет-бутил нитрон (PBN) PBN спиновый аддукт aN abH DHpp


Слайд 53

Основные виды спиновых ловушек нитрозосоединения нитроны Нитронил-нитроксилы PBN DMPO нитрозобензол трет-нитрозобутан DEPMPO NNR


Слайд 54

Основные требования к спиновым ловушкам Быстрые реакции с радикалами Отсутствие побочных реакций Образование стабильных аддуктов Отличие в параметрах спектра ЭПР спиновых аддуктов у разных радикалов


Слайд 55

Кинетические и спектральные характеристики спиновых аддуктов


Слайд 56

Идентификация радикалов по спектрам ЭПР спиновых аддуктов Если известны: (1) тип СЛ, (2) Р-ритель, (3) aN (мТ) и (4) abH (мТ) СА можно легко идентифицировать в базе данных http://epr.niehs.nih.gov спектров ЭПР.


Слайд 57

Рекомендумая литература: Дж. Вертц и Дж. Болтон Теория и практические приложения метода ЭПР. Мир, Москва, 1975. Современные методы биофизических исследований. Практикум по биофизике. Под редакцией А.Б. Рубина. Высшая школа, Москва, 1988. Метод спиновых Меток. Теория и применение. Под редакцией Л. Берлинера. Мир, Москва, 1979. Кузнецов А.Н. Метод спинового зонда. Наука, Москва, 1976. Зубарев В.Е. Метод спиновых ловушек. Издательство МГУ, Москва, 1984.


×

HTML:





Ссылка: