'

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ УКРАИНЫ Национальный технический университет Украины Факультет биотехнологии и биотехники;

Понравилась презентация – покажи это...





Слайд 0

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ УКРАИНЫ Национальный технический университет Украины Факультет биотехнологии и биотехники; Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев Отдел геномики человека Использование методов ДНК-анализа для диагностики моногенных наследственных заболеваний Островной Денис Владимирович


Слайд 1

2 Фенилкетонурия Одним из наиболее распространенных наследственных заболеваний является фенилкетонурия В Украине на 8300 новорожденных один ребенок рождается больной ФКУ


Слайд 2

3 Фенилаланингидроксилаза катализирует реакцию преобразования фенилаланин + О2 + тетрагидробиоптерин v тирозин + вода + окисленный биоптерин


Слайд 3

4 Цель работы Провести ДНК-анализ мутаций и полиморфизма гена ФАГ и оптимизировать технологию проведения полимеразной цепной реакции для амплификации in vitro последовательности ДНК седьмого экзона этого гена.


Слайд 4

5 Для достижения цели были поставлены основные задачи исследования: ДНК-анализ мутаций R408W, R158Q, Y414C, IVS10nt546, IVS12nt1 гена ФАГ ДНК-анализ мутаций в последовательности 7-го экзона гена ФАГ Анализ алельного полиморфизма VNTR-локуса 3`-нетранслированой области гена ФАГ


Слайд 5

6 Объект и предмет исследования Объект исследования - ДНК человека полученная из лейкоцитов периферической крови Предмет исследования – анализ мутаций в 5, 7, 12 экзоне и 10, 12 интроне гена ФАГ


Слайд 6

7 Методы: Выделение и очистка ДНК; амплификация in vitro последовательностей гена ФАГ методом полимеразной цепной реакции; рестрикционный анализ ПЦР-продуктов; гель-электрофорез


Слайд 7

8 Этапы ДНК-анализа: Выделение геномной ДНК из образцов венозной крови методом фенольной экстракции; Амплификация in vitro фрагмента ДНК с помощью полимеразной цепной реакции; Гидролиз ПЦР-продуктов при помощи эндонуклеаз рестрикции; Гель-электрофорез в агарозном и полиакриламидном геле.


Слайд 8

9 Схема рестрикционного анализа для детекции мутаций R408W эндонуклеазой рестрикции Eco1301 Сайт узнавания Eco1301 CC -A-T-A-C-C-T-C-G-G-C-C-C -T-A-T-G-G-A-G-C-C-G-G-G : : : : : : : : : : : : -A-T-A-C-C-T-T-G-G-C-C-C -T-A-T-G-G-A-A-C-C-G-G-G : : : : : : : : : : : : Eco1301 -A-T-A-C C-T-T-G-G-C-C-C -T-A-T-G-G-A-A-C C-G-G-G : : : : : : : : 245 п. н. 148 п. н. 97 п. н. AATT GG -A-T-A-C-C-T-C-G-G-C-C-C -T-A-T-G-G-A-G-C-C-G-G-G : : : : : : : : : : : : Сайт узнавания Eco1301


Слайд 9

10 Анализ мутации R408W. 1 2 3 4 1, 2 – R408W/норма, 3 – норма/норма, 4 – R408/R408W.


Слайд 10

11 : : : : 19 п. н. Фрагмент “нормальной” последовательности Фрагмент последовательности с мутацией R158Q -A-A-G-C 3`-T-T-C-T-G-C-C-T-T-C-5` -T-T-C-T-G-T-C-T-T-C- 5`-A-A-G-C-3` -T-T-C-G-G-C-C- T-T-C- 3`-T-T-C-T-G-C-C-T-T-C-5` : : : Схема рестрикционного анализа для детекции мутаций R158Q эндонуклеазой рестрикции MspI 5`-A-A-G-C-3` 3`-T-T-C-T-G-T-C-T-T-C-5` : : : : : : : : : -C-G-G-A-A-G-


Слайд 11

12 Анализ мутации R158Q. 123 п.н. 119 п.н. 1 2 3 4 1, 2 - R158Q/норма; 3, 4 - норма/норма.


Слайд 12

13 На первом этапе мы рассматривали четыре паралельно протикающие реакции: ДНК+Pr >ДНК.Pr Образование комплекса ДНК.Pr ДНК.Pr >ДНК+Pr Разрушение комплекса ДНК.Pr ДНК+Pr >ДНК*.Pr Образование комплекса ДНК*.Pr с неполной гомологией ДНК*.Pr >ДНК+Pr Разрушение комплекса ДНК*.Pr с неполной гомологией


Слайд 13

14 Концентрации реагентов описываются системой диф. уравнений: Решив данную систему мы получили:


Слайд 14

15 График зависимости концентрации ssДНК и комплексов ДНК.Pr, ДНК.Pr* от времени x(t) – C(ssDNA) y(t) – C(ssDNA.Pr) z(t) – 10*C(ssDNA*.Pr)


Слайд 15

16 На втором этапе мы рассматривали шесть паралельно протикающие реакции: ДНК+Pr >ДНК.Pr Образование комплекса ДНК.Pr ДНК.Pr >ДНК+Pr Разрушение комплекса ДНК.Pr ДНК+Pr >ДНК*.Pr Образование комплекса ДНК*.Pr с неполной гомологией ДНК*.Pr >ДНК+Pr Разрушение комплекса ДНК*.Pr с неполной гомологией ssДНК.Pr + dNTP > ДНК + H3PO4 Образование двухцепочечной спирали ДНК ssДНК*.Pr + dNTP > ДНК* + H3PO4 Образование двухцепочечной спирали ДНК


Слайд 16

17 Данные процессы описываются системой диф. уравнений:


Слайд 17

18 Оптимальный температурный режим отжига праймеров описывается формулой T=57.88+3.11e-0.0825?


Слайд 18

19 Зависимость концентрации ssDNA, DNA.Pr, DNA.Pr* и специфичности от времени, при температуре T=58С Где: X – концентрация одноцепочечных молекул ДНК; Y - кон. комплексов ДНК.Пр; Z - кон. не специфических скомплексов ДНК.Пр; A - кон. специфического ПЦР продукта; B - кон. не специфического ПЦР продукта; S – отношение специфического ПЦР продукта к неспецифическому; S1 – отношение специфического ПЦР продукта к неспецифическому, рассчитаная при условии что специфические и не специфические комплексы превратятся в ПЦР продукт при элонгации.


Слайд 19

20 Зависимость концентрации ssDNA, DNA.Pr, DNA.Pr* и специфичности от времени, при изменении температуры по формуле T=57.88+3.11e-0.0825? Где: X – концентрация одноцепочечных молекул ДНК; Y - кон. комплексов ДНК.Пр; Z - кон. не специфических скомплексов ДНК.Пр; A - кон. специфического ПЦР продукта; B - кон. не специфического ПЦР продукта; S – отношение специфического ПЦР продукта к неспецифическому; S1 – отношение специфического ПЦР продукта к неспецифическому, рассчитаная при условии что специфические и не специфические комплексы превратятся в ПЦР продукт при элонгации.


Слайд 20

21 Схема рестрикционного анализа для детекции мутаций R252W (эндонуклеаза рестрикции AvaI). -T-C-C-T-C-T-C-G-G-G-A-T-T- -A-G-G-A-G-A-G-C-C-C-T-A-A- : : : : : : : : : : : : : AvaI 169 п. н. 113 п. н. 56 п. н. Сайт узнавания AvaI C CG G Фрагмент “нормальной” последовательности Фрагмент последовательности с мутацией R252W CT GA -T-C-C-T-C-T-T-G-G-G-A-T-T- -A-G-G-A-G-A-G-C-C-C-T-A-A- : : : : : : : : : : : : : -T-C-C-T-C T-C-G-G-G-A-T-T- -A-G-G-A-G-A-G-C-C C-T-A-A- : : : : : : : : : Сайт узнавания AvaI -T-C-C-T-C-T-T-G-G-G-A-T-T- -A-G-G-A-G-A-G-C-C-C-T-A-A- : : : : : : : : : : : : :


Слайд 21

22 Анализ мутаций R252W 1 - R252W/норма 2 - норма/норма М - Маркер молекулярной массы


Слайд 22

23 Электрофореграмма продуктов амплификации VNTR –полиморфизма 1 2 3 4 М 1 - генотип 3/3 (380/380 п.н.); 2 - генотип 3/7 (380/500 п.н.); 3 - генотип 3/8 (380/530 п.н.); 4 - генотип 9/12 (560/650 п.н.); M - Маркер молекулярной массы ДНК плазмиды pBR322 гидролизированная эндонуклеазой MspI


Слайд 23

24 Выводы 1. Проведен ДНК-анализ мутаций R408W, IVS12nt1, R158Q, Y414C, IVS10nt546 гена ФАГ в 68 образцах. Двадцать три из них в дальнейщем использовались в качестве ДНК-матрици для амплификации седьмого экзона гена ФАГ. Подобраны условия для амплификации in vitro и рестрикции последовательности седьмого екзона гена ФАГ. 3. Рассчитана математическая модель отжига праймеров и предложен оптимальный температурный режим амплификации который представлен в виде функции T=57.88+3.11e-0.0825?. 4. Проведен анализ аллельного полиморфизма VNTR-локуса гена ФАГ с использованием специфической амплификации in vitro последовательности 3'-нетранслированного участка этого гена. 5. Проведенные иследования позволили оптимизировать анализ идентифицируемых мутаций для проведения пренатальной ДНК-диагностики фенилкетонурии с целью предупреждения рождения больных детей.


Слайд 24

25 Автор выражает благодарность: Преподавателям факультета биотехнологии и биотехники. Сотрудникам отдела геномики человека Института молекулярной биологии и генетики НАН Украины Лившиц Людмиле Аврамовне Нечипоренко Марине Владимировне Кравченко Сергею Афанасьевичу Помпуха Владимиру Николаевичу Грищенко Наталье Владимировне Ясинской Ольге Анатольевне Сима Любовь Викторовне


×

HTML:





Ссылка: