'

Хроматофокусирование: новые подходы в концентрировании и разделении   А.В.Иванов  

Понравилась презентация – покажи это...





Слайд 0

Хроматофокусирование: новые подходы в концентрировании и разделении   А.В.Иванов  


Слайд 1

2 Градиенты рН Доколоночные (внешние) - Только подвижные фазы - Необходимы смесители и т.д. [пример узла установки “Waters ALC-100”, 1978 г.] Внутриколоночные (внутренние) - Подвижные полибуферные фазы + сорбент - Оборудование для изократического элюирования


Слайд 2

3 Хроматофокусирование (ХФ) Метод ионообменной хроматографии, основанный на формировании линейного градиента рН внутри колонки (L.Sluyterman; Uppsala, 1979-81) объекты: биологические биполярные соединения (белки, ферменты, и т.д.) Техника получения градиента рН в уравновешенной стартовым раствором СР колонке (рН1) при пропускании буферного элюента Э (рН2) Слабоосновный анионообменник (-NR2) – нисходящий градиент; Слабокислотный катионообменник (-COOH)- восходящий градиент


Слайд 3

4 Техника хроматофокусирования (ХФ)


Слайд 4

5 Фокусирующий эффект при разделении биполярных соединений (из книги “Хроматофокусирование полибуфером на ПБИ”, Stockholm-Uppsala, 1982)


Слайд 5

6 Преимущества хроматофокусирования не требуется дополнительное оборудование (градиентный насос, система смесителей); высокая нагрузочная емкость колонок, концентрирование и разделение на одной колонке; высокая воспроизводимость градиентов (sr?0,02), широкий рабочий интервал рН (до 4-5 ед.); фокусирующий эффект (для биполярных соединений) НО: основное ограничение – полиамфолитные элюенты


Слайд 6

Новые направления ХФ 1. Техника ХФ для концентрирования и разделения переходных металлов 3. ХФ пептидов на сульфокатионитах (не имеют буф. емкости) 2. Поиск простых подвижных фаз для ХФ (одно-, двухкомпонентные


Слайд 7

8 1. Хроматофокусирование ионов переходных металлов Анионообменные сорбенты: PBE-94 (Pharmacia); кремнеземы (Силохром, Силасорб) с привитыми олигоэтиленаминами – En-, Dien-, Tetren-; AP- (аминопропил-) Катионообменные сорбенты: полимеры (МГЦ, ССПС и ПММА) с привитыми карбоксильными группами -СООН, -СН2СООН Удерживание ионов металлов за счет комплексообразования при более высоких рН и элюирование при плавном снижении рН в слое сорбента (концентрирование и разделение)


Слайд 8

9 Комплексообразующие сорбенты для ХФ ионов металлов (впервые – нисходящие градиенты рН на карбоксильных сорбентах) [12 сорбентов]


Слайд 9

10 Хроматофокусирование (ХФ) ионов металлов на анионообменных сорбентах сорбент - а) PBE-94; б) Tetren-SiO2 (колонка 300х9 мм) СР - 25 мМ Трис-HCl (pH 7,5), Э - 1:8 Полибуфер-74 (pH 3,3), 1 мл/мин Детектирование - по реакции с ПАР (540 нм)


Слайд 10

11 Разделение и концентрирование ионов металлов сорбент MacroPrep 50 CM (50 мкм, 50x4,6 мм) СР: 10 мМ Трис-HCl (pH 7,5), IСР: 0,1 (NaCl) Э: 0,5 мМ лимонная к-та (pH 3,4), IЭ: 0,1 (NaCl); 1 мл/мин Детектирование: УФ (254 нм) сорбент MN (5 мкм, 50x4,6 мм) СР: 10 мМ Трис-HCl (pH 7,1), IСР: 0,05 Э: 1 мМ лимонная к-та (pH 3,3), IЭ: 0,05; 1 мл/мин Проба: 2 х 10-5 М Cu2+, 30 мл Детектирование: УФ (254 нм)


Слайд 11

12 Концентрирование ионов переходных металлов


Слайд 12

13 Техника индуцирования: введение конц. индуцирующего раствора ИР (рН2) в поток разбавленного буферного элюента Э (рН1) (K.Slais; Brno, 1992-94; А.Иванов, 1994-95) ? сокращение времени в 3-4 раза


Слайд 13

14 Разделение ионов металлов с индуцированным градиентом рН сорбент - а) Dien-SiO2 (100-120 мкм, 150х2 мм); б) Tetren-SiO2 ИР – 1 мл 100 мМ Na2B4O7, Э – а) 10 мМ (6-аминогексановая к-та + гистидин); 0,2 мл/мин; б) 20 мМ, Детектирование - по реакции с ПАР (540 нм)


Слайд 14

15 2. Новые простые подвижные фазы для хроматофокусирования Традиционно – полиамфолитные элюенты (“полибуферы”) Преимущества: постоянная буферная емкость в широком диапазоне рН > широкий рабочий интервал рН Но: сложный синтез, высокая стоимость, низкая устойчивость к биодеградации; трудно отделять от белков и пептидов; высокий УФ-сигнал


Слайд 15

16 Подходы к поиску подвижных фаз – стартовых растворов и элюентов эмпирический - экспериментальная проверка смесей кислот, оснований и амфолитов – до 20 - 25 компонентов (Hutchens, 1985-86) на основе моделирования (учет свойств сорбентов, активных компонентов подвижных фаз, наличие сильного электролита): сорбент – полифункциональный, полиэлектролитный СР – слабое основание + электролит (NaCl) Э – слабая кислота + основание + электролит (NaCl)


Слайд 16

17 2.1. Как избавиться от подъема рН на нисходящем градиенте? IЭ < IСР сорбент Tetren-SiO2 (7,5 мкм, 1 мМ/г, 250x4,6 мм) СР: 25 мМ Трис-10 мМ H2C2O4 (pH 7,5), IСР: 1 - ~0; 2 - 0,1; 3 - 1 Э: 20 мМ H2C2O4 -22 мМ Трис (pH 3,5), IЭ: ~0,05


Слайд 17

18 Нисходящие градиенты рН в анионообменных колонках полифункциональные сорбенты с полиэлектролитными свойствами; элюенты с минимальным содержанием слабых оснований; IЭ < IСР для формирования плавного градиента ионную силу элюента следует понижать, для более резкого градиента - повышать


Слайд 18

19 Разделение изоформ плазминогенов сорбент Tetren-SiO2 (7,5 мкм, 50x4,6 мм) СР: 25 мМ Трис-HCl (pH 7,5), IСР: 0,02 Э: 2 мМ H2C2O4 (pH 2,9), IЭ: ~0; 1 мл/мин Проба: 20 мкл лиофилизов. смеси Glu- и Lys-плазминогенов (pI 5,82 и 5,66), активность 1 мг/мл Детектирование - УФ (280 нм)


Слайд 19

20 Разделение смеси металлов сорбент PBE-94 (>100 мкм, 300x9 мм) СР: 25 мМ Трис-HCl (pH 7,5), IСР: 0,05 Э: 20 мМ глутаминовая к-та (pH 3,3), 1 мл/мин Детектирование - по реакции с ПАР (540 нм)


Слайд 20

21 Эффект ионной силы подвижных фаз для карбоксильных колонок сорбент Macro-Prep 50 CM (50 мкм, 50x4,6 мм) СР: 10 мМ Трис-HCl (pH 7,5), Э: 1 мМ (1) и 0,5 мМ (2) лимонная кислота (pH 3,3 - 3,5); 1 мл/мин, ионная сила подвижных фаз: 1 - 0,01; 2 - 0,1


Слайд 21

22 Квази-линейные нисходящие градиенты рН в катионообменных колонках сорбенты с полиэлектролитными свойствами; слабое основание в элюенте не влияет на профиль градиента, а лишь на конечное значение рН; IЭ ? IСР (~0,05 – 0,2) для получения плавного градиента можно использовать однокомпонентные Э с высокой ионной силой (как в СР)


Слайд 22

23 2.2. Восходящие градиенты рН Мало изучены для применения в ХФ Подвижные фазы - полиамфолиты Эффект ионной силы не исследован Перспективны для разделения белков, пептидов и др. биполярных макромолекул


Слайд 23

24 Выбор элюента для восходящих градиентов рН сорбент Macro-Prep 50 CM (50 мкм, 50x4,6 мм) СР: 2 мМ лимонная к-та (pH 3,3), Э (рН 7,5): 1:25 “Полибуфер” (1); 12,5 мМ Трис-HCl (2); 12,5 мМ Трис-HCl + 1 мМ лимонная к-та (3); 12,5 мМ Трис-HCl + 6 мМ лимонная к-та (4); 1 мл/мин


Слайд 24

25 ХФ альбуминов с восходящим градиентом сорбент Macro-Prep 50 CM (50 мкм, 50x4,6 мм) СР: 2 мМ лимонная к-та + 1,5 мМ Трис (pH 3,3), IСР: ~0 Э: 20 мМ Трис-HCl + 5 мМ лимонная к-та (рН 7,6); 1 мл/мин; IЭ: 0,5 Проба: овальбумин (Oval.) и бычий альбумин (BSA), 0,5 мг/мл Детектирование: УФ (280 нм)


Слайд 25

26 ХФ образца формиатдегидрогеназы на сорбенте низкой емкости сорбент MN (5 мкм, 50x4,6 мм) СР: 2 мМ лимонная к-та (pH 3,0), IСР: 0,05 (NaCl) Э: 10 мМ Трис-лимонная к-та (рН 7,5); 1 мл/мин; IЭ: ~0 Проба: ФДГ из клеточного лизата с активностью 1 мг/мл Детектирование: УФ (280 нм)


Слайд 26

27 Квази-линейные восходящие градиенты рН в карбоксильных колонках 1. сорбенты с высокой емкостью: слабое основание в стартовом растворе влияет на начальный участок градиента рН; IЭ > IСР ( от 0,1) 2. сорбенты с низкой емкостью: слабое основание в стартовом растворе не влияет на начальный участок градиента рН; IЭ < IСР либо IЭ ? IСР (~0,05)


Слайд 27

28 3. Хроматофокусирование пептидов на сульфокатионитах Возможность разделения пептидов Проблема: полиамфолитные элюенты осложняют детектирование (? < 220 нм) – только “ароматика” Отсутствие буферной емкости сорбента Исключительная роль элюента Сильно- и слабоудерживаемые пептиды


Слайд 28

29 Подвижные фазы для ХФ на сильно-кислотном сорбенте сорбент PRP-X200 (10 мкм, 200x4,6 мм) СР: 5 мМ NaH2PO4 (pH 3,0), IСР: ~0 (1 и 2), 0,1 (3), 0,5 (4) Э: 10 мМ NaH2PO4 + 6 мМ Трис (рН 7,0), IЭ: ~0 (1 и 4), 0,3 (2 и 3); 1 мл/мин


Слайд 29

30 ХФ трипсинового гидролизата альбумина сорбент PRP-X200 (10 мкм, 200x4,6 мм) СР: 5 мМ NaH2PO4 (pH 3,0), IСР: 0,5 (NaCl) Э: 10 мМ NaH2PO4 + 6 мМ Трис (рН 7,0), 1 мл/мин, IЭ: ~0 Проба: гидролизат человеческого альбумина (0,1 мг) Детектирование: УФ (214 нм)


Слайд 30

31 ХФ гидролизата альбумина при одновременном градиенте ионной силы сорбент PRP-X200 (10 мкм, 200x4,6 мм) СР: 3 мМ NaH2PO4 + 10% CH3CN (pH 3,0), IСР: 0,1 (NaCl) Э: 10 мМ NaH2PO4 + 6 мМ Трис + 10% CH3CN (рН 7,0), 1 мл/мин, IЭ: 0,3 (NaCl) Детектирование: УФ (214 нм)


Слайд 31

32 Линейные восходящие градиенты рН в сильно-кислотных колонках активные компоненты стартового раствора и элюента – одной природы; добавки CH3CN (~10%) в обе фазы IСР (~0,1) < IЭ (~0,3) (сочетание градиента рН с градиентом ионной силы)


Слайд 32

33 Выводы “Устоявшийся” метод хроматофокусирования может развиваться в следующих направлениях: 1. Предложено использовать технику хроматофокусирования и индуцирования для концентрирования и рН-градиентного разделения ионов металлов на комплексообразующих анионитах и катионитах. 2. Коммерческие “Полибуферы” можно заменить простыми одно- двухкомпонентными элюентами при создании высокой ионной силы в одной или обеих подвижных фазах. Возможности простых элюентов показаны на примере разделения металлов; аминокислот; белков; ферментов. Фокусирующий эффект для биполярных молекул усиливается за счет градиента ионной силы. 3. Технику хроматофокусирования можно использовать в сочетании с градиентом ионной силы для разделения смесей пептидов на сульфокатионитах.


Слайд 33

34 Публикации Опубликовано 80 статей, из них по теме работы - 57: 2 обзора (ЖАХ, 1999; Вестник МГУ, 2005) 55 статей: ЖАХ – 9 ЖФХ – 14 Вестник МГУ – 24 Сорбционные процессы – 3 Fresenius J., Mendeleev Comm., J. Liquid Chrom., J.Chromatogr., Известия ВУЗов, Молекулярные технологии Тезисы докладов – 50: XVI, XVII, XVIII Менделеевские съезды; IICS-92, 93, 94, 2000, 2004; ICAS-97, 2006; SBS-03; Всеросс. симп. по хроматографии 1998-2008; “Разделение и концентрирование в аналитической химии”; “Ломоносовские чтения-2005”; “Аналитика России-2007” и др. Диссертации: А.В. Иванов “Хроматофокусирование переходных металлов” (1997), А.Б. Тессман “Формирование внутренних градиентов рН в ионообменной хроматографии: моделирование и экспериментальная проверка” (2000), М.С. Вакштейн ”Новые подвижные фазы для хроматофокусирования в катионообменных системах” (2006).


Слайд 34

35 Благодарность докт. хим. наук П.Н.Нестеренко, О.А.Шпигуну; канд. хим. наук А.В. Гармашу; аспирантам А.Б. Тессману, М.С. Вакштейну, С.С. Кубышеву, дипл. Н.Ю. Смирновой; проф. К. Шлайсу и дипл. Т. Рейтару (Чехия) за плодотворное сотрудничество РФФИ – за финансовую поддержку исследования (проекты № 02-03-33007 и 05-03-33096)


Слайд 35

36 Индуцированные градиенты в карбоксильных колонках сорбент Macro-Prep 50 CM (50x4,6 мм) Э: 8 мМ СН3СООН (pH 3,6), ионная сила: 1 и 3 - 0,1; 2 - ~0 ИР: 1 мл 3,25 М NH3 (рН 11), ионная сила: 1 - 1; 2 и 3 - ~0


Слайд 36

37 Индуцированные градиенты в карбоксильных колонках сорбент Macro-Prep 50 CM (50 мкм, 50x4,6 мм) ИР: 1 мл [4 М CH3COONa + 1 M NaCl (1, 3)] (pH 11,9) Э: 5 мМ СН3СООН (pH 3,6), ионная сила (NaCl): 1, 2 – 0, 3 – 0,1 M; 1 мл/мин


Слайд 37

38 Разделение ионов металлов с индуцированным градиентом рН сорбент Macro-Prep 50 CM (50 мкм, 50x4,6 мм) ИР: 1 мл (4 М CH3COONa + 1 M NaCl) (pH 11,9) Э: 5 мМ СН3СООН + 0,1 M NaCl (pH 3,6), 1 мл/мин Детектирование - УФ (254 нм): 1 - Pb2+, 2 - Co2+


Слайд 38

39 Эксперимент и модель: различие в ионной силе стартового раствора и элюента (анионообменная система) IЭ > IСР 1 - сорбент Dien-SiO2 (100-160 мкм, 0,35 мМ/г) 2 - модель Tetren-SiO2 СР -25 мМ Трис-HCl (pH 7,5), Э - 5 мМ CH3COOH + NaCl (pH 3,5)


Слайд 39

40 Различие в ионной силе стартового раствора и элюента IЭ < IСР сорбент Tetren-SiO2 (7,5 мкм, 1 мМ/г, 250x4,6 мм) СР: 25 мМ Трис-HCl (pH 7,5), IСР: 1 - ~0,03; 2 - 0,1; 3 - 1; 4 - 0,02 Э: 2 мМ H2C2O4 (pH 2,9), IЭ: 1, 2 и 3 - ~0; 4 - 0,5


Слайд 40

41 Модельная смесь аминокислот сорбент Tetren-SiO2 (7,5 мкм, 50x4,6 мм) СР: 25 мМ Трис-HCl (pH 7,5), IСР: 0,02 Э: 2 мМ H2C2O4 (pH 2,9), IЭ: ~0; 1 мл/мин Детектирование - УФ (280 нм)


Слайд 41

42 Формирование градиента рН однокомпонентными элюентами в катионообменной системе сорбент MN (5 мкм, 50x4,6 мм) СР: 10 мМ Трис-HCl (pH 7,5) Э: 1 мМ кислоты - 1 – щавелевая, 2 - винная, 3 – лимонная, 4 – глутаминовая, 5 – уксусная; 1 мл/мин


Слайд 42

43 Как избавиться от подъема рН? сорбент MN (5 мкм, 50x4,6 мм) СР: 10 мМ Трис-HCl (pH 7,5) Э: 0,2 мМ лимонная кислота (pH 3,7-3,9); 1 мл/мин, ионная сила подвижных фаз: 1 - ~0; 2 - 0,01, 3 - 0,1 (NaCl)


Слайд 43

44 Анионообменные сорбенты (для ХФ ионов металлов)


Слайд 44

45 Карбоксильные сорбенты (для ХФ ионов металлов) Впервые – нисходящие градиенты рН


Слайд 45

46 Квази-линейные градиенты рН на сорбенте с низкой емкостью сорбент MN (5 мкм, 50x4,6 мм) СР: 2 мМ лимонная к-та (pH 3,0), IСР: ~0 (1 и 2), 0,05 (3 и 4) Э: 10 мМ Трис-лимонная к-та (рН 7,0), IЭ: ~0 (1 и 3), 0,05 (2 и 4); 1 мл/мин


Слайд 46

47 Влияние добавок ацетонитрила в условиях градиента рН сорбент PRP-X200 (10 мкм, 200x4,6 мм) СР: 5 мМ NaH2PO4 + 20% CH3CN (pH 3,0) Э: 10 мМ NaH2PO4 + 6 мМ Трис + 20% CH3CN (рН 7,0), 1 мл/мин Детектирование: УФ (214 нм)


Слайд 47

48 Влияние ионной силы в карбоксильной колонке сорбент Macro-Prep 50 CM (50 мкм, 50x4,6 мм) СР: 2 мМ лимонная к-та + 1,5 мМ Трис (pH 3,3), Э (рН 7,6): 20 мМ Трис-HCl + 5 мМ лимонная к-та; 1 мл/мин; ионная сила: 0 (1), 0,01 (2), 0,5 (3)


×

HTML:





Ссылка: