'

Исследование антиоксидантных и прооксидантных свойств некоторых структурно близких флавоноидов

Понравилась презентация – покажи это...





Слайд 0

Белорусский государственный университет Биологический факультет Кафедра биохимии Исследование антиоксидантных и прооксидантных свойств некоторых структурно близких флавоноидов Магистерская диссертация Долгодилиной Елены Викторовны Научный руководитель к.б.н., доцент Кукулянская Татьяна Александровна Минск 2009


Слайд 1

Содержание Актуальность исследования Цель и задачи Материалы и методы Результаты Выводы V V V V V


Слайд 2

Актуальность темы Свободные радикалы неминуемо образуются в клетке в процессе жизнедеятельности и, присутствуя в живых системах, вызывают повреждения макромолекул в клетке, что приводит к ряду негативных последствий. Как у растительных организмов, так и у животных имеются специальные антиоксидантные системы, функция которых и сводится к инактивации свободных радикалов. Условно такие системы можно разделить на две части: первая включает такие ферменты, как пероксидазу, каталазу, супероксиддисмутазу, а вторая - аскорбиновую кислоту, гидрохинон, кверцетин и другие низкомолекулярные соединения В ходе исследований показано, что наиболее токсичные радикальные продукты пероксидазного окисления удаляются, главным образом, отдельными биоантиоксидантами, к которым относятся и флавоноиды. Установлено также, что флавоноиды обладают выраженными антиаллергическими, антиканцерогенными, противовоспалительными и противовирусными свойствами


Слайд 3

Цели и задачи Цель настоящей работы: изучение антиоксидантных и прооксидантных свойств структурно близких флавоноидов в процессах, сопровождающихся генерацией АФК, первичных и вторичных свободных радикалов. В соответствии с целью данной работы были поставлены следующие задачи: изучить влияние таких флавоноидов, как кверцетина, эпикатехина и гесперетина, на ПОЛ, вызванное различными индукторами; исследовать влияние выше указанных флавоноидов на процесс метаболической активации аминобифенилов по пероксидазному пути окисления; изучить возможность данных флавоноидов выступать в качестве субстратов для пероксидазы;


Слайд 4

Материалы и методы В работе использовались следующие вещества и ферменты: 3,3’,5,5’-тераметилбензидин, кверцетин, гесперетин, эпикатехин, лецитин соевый производства «Sigma», США НАДН производства «Renaul» Венгрия Твин 20 производства «Ferak», Германия ДНК фага ? производства «Сибэнзим», Россия o-дианизидин, пероксид водорода, диметилформамид, С2Н5ОН, хлороформ, FeSO4, тиобарбитуровая кислота и другие реактивы квалификации марки «ЧДА» пероксидаза из хрена (КФ 1.11.1.7) с Rz = 3 и СОД (КФ 1.15.1.1) производства «Fluka», США Во время выполнения работы были использованы следующие методы анализа: спектральные (измерения проводили на спектрофотометрах Solar PV 150, UV-VIS Cary-50 в УФ и видимом диапазоне длин волн ) электрофоретические.


Слайд 5

Основная часть Общая структура флавоноидов Флавоноиды – это фенольные соединения, широко распространённые в природе. Общая структура флавоноидов (С6 — С3 — С6 ) представлена двумя ароматическимих кольцами, соединенными тремя углеродными атомами, наиболее часто с образованием гетероциклического кольца


Слайд 6

Механизмы антиоксидантной активности флавоноидов могут быть следующие : Подавление формирования активных форм кислорода путем ингибирования ферментов или хелатирование микроэлементов, учавствующих в образовании свободных радикалов. Удаление активных форм кислорода. Благодаря более низким окислительно-восстановительным потенциалам, флавоноиды (Fl-ОН) способны восстанавливать высоко окисленные свободные радикалы Сверхрегулирование или защита протекторов антиоксидантов


Слайд 7

Накопление продуктов ПОЛ в присутствии кверцетина, гесперетина и эпикатехина На рисунке слева представлено накопление продуктов ПОЛ, индуцированное СФ, в присутствии кверцетина, гесперетина и эпикатехина (1.- спонтанное ПОЛ, 2.- ПОЛ, индуцированное СФ (2?10-4М Fe2+/2?10-5 М Н2О2) в отсутствии флавоноидов; для флавоноидов : 3.- 1?10-7М, 4. - 5?10-7 М,5.- 1?10-6 М,6.- 5?10-6 М,7.- 1?10-5 М, 8. - 5?10-5 М,9. - 1?10-4 М) На рисунке справа представлено накопление продуктов ПОЛ, индуцированное Fe2+, в присутствии кверцетина, гесперетина и эпикатехина (1.- спонтанное ПОЛ, 2.- ПОЛ, индуцированное Fe2+ в концентрации 2? 10-4 М в отсутствие флавоноидов;для флавоноидов : 3.- 1?10-7М, 4. - 5?10-7 М, 5. - 1?10-6 М,6.- 5?10-6 М,7.- 1?10-5 М, 8. - 5?10-5 М,9. - 1?10-4 М) Примечание II: * - различия достоверны при р ? 0,05


Слайд 8

Пероксидазное окисление 3, 3’,5,5’-тераметилбензидина (ТМБД) Подробный механизм окисления ТМБД


Слайд 9

Влияние флавоноидов на процесс пероксидазного окисления 3,3’,5,5’-тераметилбензидина Пероксидазное окисление ТМБД в 0,1 М цитратно - ацетатном буфере рН 5,5 (конечный объём реакционной смеси составлял 2,5 мл и содержал [Н2О2]=0,4 мМ/л, [ПХ]=10-11 М, [ТМБД]= 0,6 мМ/л) в присутствии кверцетина: 1 - [кверцетин] =0 мкМ/л, 2 - [кверцетин] =0,01 мкМ/л, 3 - [кверцетин] =0,04мкМ/л, 4 - [кверцетин] =0,08 мкМ/л, 5 - [кверцетин] =0,12 мкМ/л, 6 - [ кверцетин] =0,2 мкМ/л, 7 - [кверцетин] =0,6 мкМ/л, 8 - [кверцетин] =1 мкМ/л, 9 - [ кверцетин] =4 мкМ/л.


Слайд 10

Химические формулы кверцетина, гесперетина и эпикатехина


Слайд 11

Пероксидазное окисление кверцетина Окисление протекало в 0,1 М цитратно – ацетатном буфере (рН 5,5), [ПХ]= 10-11 М, [Н2О2]=50 мкмоль/л: 1 - [кверцетин] = 75 мкмоль/л, 2 - [кверцетин] = 65 мкмоль/л, 3 - [кверцетин] =55 мкмоль/л, 4 - [кверцетин] =45 мкмоль/л, 5 - [кверцетин] =35 мкмоль/л, 6 - [кверцетин] = 25 мкмоль/л, 7 - [кверцетин] = 20 мкмоль/л, 8 - [кверцетин] = 10 мкмоль/л, 9 - [кверцетин] = 5 мкмоль/л.


Слайд 12

Пероксидазное окисление эпикатехина Окисление протекало в 0,1 М цитратно – ацетатном буфере (рН 5,5), [Н2О2]=50 мкмоль/л : На рисунке слева: [ПХ]= 10-11 М, 1 - [эпикатехин] = 105 мкмоль/л, 2 - [эпикатехин] = 95 мкмоль/л, 3 - [эпикатехин] =85 мкмоль/л, 4 - [эпикатехин] =75 мкмоль/л, 5 - [эпикатехин] =55 мкмоль/л, 6 - [эпикатехин] = 25 мкмоль/л, 7 - [эпикатехин] = 20 мкмоль/л, 8 - [эпикатехин] = 5 мкмоль/л. На рисунке справа: [ПХ]= 10-9 М, 1 - [эпикатехин] = 105 мкмоль/л, 2 - [эпикатехин] = 95 мкмоль/л, 3 - [эпикатехин] =75 мкмоль/л, 4 - [эпикатехин] =65 мкмоль/л, 5 - [эпикатехин] =55 мкмоль/л, 6 - [эпикатехин] = 45 мкмоль/л, 7 - [эпикатехин] = 35 мкмоль/л, 8 - [эпикатехин] = 25 мкмоль/л, 9 - [эпикатехин] = 20 мкмоль/л, 10 - [эпикатехин] =10 мкмоль/л, 11 - [эпикатехин] =5 мкмоль/л


Слайд 13

Электрофореграмма ДНК фага ?, инкубированной в системе пероксидазного окисления о-дианизидина Электрофореграмма ДНК фага ?, инкубированной в системе пероксидазного окисления о-дианизидина ([ДНК] =0,4мкг, [Н2О2] = 1 ммоль/л, [ПХ] = 10-7 моль/л): 1. ДНК, 2. ДНК, ПХ, Н2О2, 3. ДНК, ПХ, о-дианизидин 5?10-5 моль/л, 4. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин 10-7 моль/л, 5. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин 2,5?10-7 моль/л, 6. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин 5?10-7 моль/л, 7. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин 10-6 моль/л,8. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин 2,5?10-6 моль/л, 9. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин 5?10-6 моль/л, 10. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин 10-5 моль/л, 11. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин 2,5?10-5 моль/л, 12. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин 5?10-5 моль/л.


Слайд 14

Влияние кверцетина на повреждение ДНК продуктами пероксидазного окисления о-дианизидина Электрофореграмма ДНК фага ?, инкубированной в системе пероксидазного окисления о-дианизидина ( [о-дианизидин]= 5?10-6 моль/л, [ДНК] =0,4мкг, [Н2О2] = 1 ммоль/л, [ПХ] = 10-7 моль/л) с различными концентрациями кверцетина : 1. ДНК, 2. ДНК, ПХ, Н2О2, 3. ДНК, ПХ, о-дианизидин, 4. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, 5. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, кверцетин 1?10-8 моль/л, 6. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, кверцетин 5?10-8 моль/л, 7. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, кверцетин 1?10-7 моль/л, 8. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, кверцетин 5?10-7 моль/л, 9. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, кверцетин 1?10-6 моль/л, 10. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, кверцетин 5?10-6 моль/л, 11. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, кверцетин 1?10-5 моль/л, 12. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, кверцетин 1?10-4 моль/л.


Слайд 15

Влияние эпикатехина на повреждение ДНК продуктами пероксидазного окисления о-дианизидина Электрофореграмма ДНК фага ?, инкубированной в системе пероксидазного окисления о-дианизидина ( [о-дианизидин]= 5?10-6 моль/л, [ДНК] =0,4мкг, [Н2О2] = 1 ммоль/л, [ПХ] = 10-7 моль/л) с различными концентрациями эпикатехина: 1. ДНК, 2. ДНК, ПХ, Н2О2, 3. ДНК, ПХ, о-дианизидин, 4. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, 5. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, эпикатехин 1?10-8 моль/л, 6. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, эпикатехин 5?10-8 моль/л, 7. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, эпикатехин 1?10-7 моль/л, 8. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, эпикатехин 5?10-7 моль/л, 9. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, эпикатехин 1?10-6 моль/л, 10. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, эпикатехин 5?10-6 моль/л, 11. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, эпикатехин 1?10-5 моль/л, 12. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, эпикатехин 1?10-4 моль/л.


Слайд 16

Влияние гесперетина на повреждение ДНК продуктами пероксидазного окисления о-дианизидина Электрофореграмма ДНК фага ?, инкубированной в системе пероксидазного окисления о-дианизидина ([о-дианизидин]= 5?10-6 моль/л, [ДНК] =0,4мкг, [Н2О2] = 1 ммоль/л, [ПХ] = 10-7 моль/л) с различными концентрациями гесперетина : 1. ДНК, 2. ДНК, ПХ, Н2О2, 3. ДНК, ПХ, о-дианизидин, 4. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, 5. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, гесперетин 1?10-8 моль/л, 6. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, гесперетин 5?10-8 моль/л, 7. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, гесперетин 1?10-7 моль/л, 8. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, гесперетин 5?10-7 моль/л, 9. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, гесперетин 1?10-6 моль/л, 10. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, гесперетин 5?10-6 моль/л, 11. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, гесперетин 1?10-5 моль/л, 12. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, гесперетин 1?10-4 моль/л.


Слайд 17

Выводы Было показано, что в процессе перекисного окисления лецитина, индуцированного системой Фентона ([Fe2+]= 2?10-4 моль/л, ([Н2О2]= 2?10-5 моль/л), кверцетин, эпикатехин и гесперетин проявляют прооксидантные свойства. Наибольшая прооксидантная активность проявляется кверцетином в концентрации 5?10-7 моль/л, гесперетином - 1?10-7 моль/л, эпикатехином - 1?10-6 моль/л. Установлено, что если в качестве индуктора перекисного окисления липидов выступает Fe2+ (2?10-4 моль/л), то кверцетин проявляет антиоксидантные свойства и максимальная антиоксидантная активность наблюдается в концентрации 1?10-4 моль/л. Эпикатехин и гесперетин в указанных условиях проявляют как антиоксидантные, так и прооксидантные свойства. Гесперетин проявляет антиоксидантную активность в концентрациях 5?10-7 - 1?10-6 моль/л, а прооксидантную - 5?10-6 и 5?10-5 моль/л. Эпикатехин выступает антиоксидантом в концентрациях с 1?10-6 по 1?10-5 моль/л, а при концентрации 1?10-4 моль/л наблюдается прооксидантный эффект.


Слайд 18

Показано, что кверцетин и эпикатехин в концентрациях 1 мкмоль/л и 4 мкмоль/л проявляют антиоксидантные свойства в отношении процесса пероксидазного окисления 3,3’,5,5’-тераметилбензидина, при этом кверцетин гораздо эффективнее подавляет окисление данного аминобифенила. Наиболее вероятно, что при совместном окислении тетраметилбензидина и флавоноидов (кверцетина, эпикатехина) происходит активация окисления медленно окисляемого субстрата (флавоноида) и частичное или полное ингибирование превращения быстро окисляемого субстрата (аминобифенила) Было установлено, что кверцетин и эпикатехин, проявляя антиоксидантные свойства, способны подвергаться окислению в системе пероксидаза/ Н2О2. В случае кверцетина наиболее вероятным механизмом является одноэлектронное окисление флавоноида: пх/ Н2О2 Fl > Fl? ( одноэлектронное окисление) Fl? +НАДН > Fl + НАД? НАД? + О2 > НАД+ + ?О2 –


Слайд 19

Установлено, что все три флавоноида – кверцетин, эпикатехин и гесперетин - проявляют антиоксидантные свойства и ингибируют повреждение ДНК радикалами, образующимися в ходе пероксидазного окисления о-дианизидина. Наиболее эффективными ингибиторами являются кверцетин, эпикатехин (в концентрации 5?10-7 моль/л), менее эффективен гесперетин (1?10-5 моль/л).


Слайд 20

Спасибо за внимание!!! Exit


×

HTML:





Ссылка: