Цитокины семейства Фактора Некроза Опухолей

Слайд 0

Цитокины семейства Фактора Некроза Опухолей С.А. Недоспасов Институт Молекулярной Биологии РАН им. Энгельгардта, Институт Физико-Химической Биологии им. Белозерского, МГУ Лекция 2

Слайд 1

…Фактор некроза опухолей представляется мне «водородом» всех цитокинов на Земле....(Д.И. Менделеев, из письма Л. Олду)

Слайд 2

Фактор некроза опухолей (ФНО, TNFa) Многофункциональный цитокин (мономер-17кД). Передает сигналы как клеточной смерти, так и активации экспрессии генов. Используется в некоторых протоколах противоопухолевой терапии. Связан с развитием септического шока. Играет важную роль в развитии иммунного ответа и воспаления, и в поддержании архитектуры вторичных лимфоидных органов Связан с развитием аутоиммунных заболеваний.

Слайд 3

Bharat Aggarwal George Kollias David Goeddel Bruce Beutler Доска Почета по отделу ФНО Lloyd Old

Слайд 4

Благодарность за помощь в подготовке лекций Дмитрий Купраш Сергей Гривенников Ян Вилчек

Слайд 5

Mitogenesis, collagenase, cytokines Inhibition of lipoprotein lipase, insulin resistance Altered function, Apoptosis Activation, apoptosis, IFN-g, IL-2, other cytokines Activation, TNF, IL-1, IL-6, iNOS STIMULUS (Bacteria, Viruses,Cytokines) Bone resorption Acute phase proteins Fever, sleep Antibodies iNOS Cytokines, adhesion molecules, coagulation factors, Monocyte Endothelium B cell T cell Brain TNF Liver Adipocyte Fibroblast Myocyte Osteoclast Monocyte/Macrophage

Слайд 6

Ligands and Receptors of the LT-TNF Subfamily LT?3 LT?2 LT?1 TNF3 TNFRII TNFRI LT?R LIGHT HVEM T-cells Immature DCs T-cells B-cells NK cells T-cells B-cells NK cells? Macrophages Neutrophils Dendritic cells NK cells Mast cells T-cells B cells Enterocytes Endothelial cells Most cell types Stromal cells Macrophages Mast cells Dendritic cells Immature DCs T-cells B cells NK cells Monocytes Endothelial cells

Слайд 7

Fos Jun AP1 p50 p65 IkBa IKKa IKKb IKKg GENE ACTIVATION MEKK3 NFkB SODD JNK DD DD FADD APOPTOSIS DD TNFR1 Pro-caspase-8 Pro-caspase-10 Effector caspases TNFR1 TRADD TNF c-FLIP DD DD DD DD DD RIP DED DED TRAF2 TAK1 MAP3K c-IAP1,2 MAPK phosphatase Cyt- c caspase 3 ROS

Слайд 8

deleterious beneficial Lymphoid microarchitecture Host defense Systemic toxicity Autoimmunity «Плохой» и «хороший» TNF in vivo.

Слайд 9

deleterious beneficial Lymphoid microarchitecture Host defense Systemic toxicity Autoimmunity «Плохой» и «хороший» ФНО in vivo. Как ФНО, продуцируемый индивидуальными типами клеток, вносит вклад в баланс между «плохим» и «хорошим»?

Слайд 10

Баланс «полезных» и «вредных» свойств ФНО Что произойдет при системном блокировании ФНО у больных (препараты Infliximab, Etanercept)? - Инфекции (ТБ), лимфомы?

Слайд 11

Генетический нокаут: изучение физиологических последствий инактивации одного единственного гена. Проблема №1: из-за вырожденности функций близкородственных генов генетический нокаут может не «вскрыть» всех физиологических функций продукта гена. Проблема №2: практически при любой технологии генетического нокаута нельзя полностью исключить нарушения регуляции соседних генов. Проблема №3: точечная мутация может давать другой фенотип, чем нокаут. (Технология «нок-ин» позволяет воссоздать организм с выбранной точечной мутацией). Краткое введение в нокауты: «обратная» генетика

Слайд 12

Стадии генетического нокаута

Слайд 13

Технология генетического нокаута с использованием Cre/loxP или Flp/Frt систем(precision targeting) Adapted from Nature Reviews | Genetics

Слайд 14

Мишень для генетических манипуляций: локус ФНО-ЛТ мыши LTb LTa TNF 1 kb Receptors: TNFR1 Mouse chromosome 6 LTbR Mouse chromosome 6 TNFR2 Mouse chromosome 4 Chromosome 17 MHC class III MHC class I

Слайд 15

Панель мышей с кондиционной инактивацией гена ФНО Mice with “floxed” TNF gene loxP X Mice with TNF gene deletion in specific cell types X = “Deleter” mice with restricted expression of Cre recombinase CD4-Cre = X CD19-Cre Mx-Cre = MLys-Cre = Macrophages, neutrophils X loxP TNF Inducibly, in all cells

Слайд 16

Эффективность и специфичность делеции гена ФНО в М-ФНО мышах 0 200 400 600 800 TNF, pg/ml WT M-TNF 0 200 400 600 800 1000 1200 TNF, pg/ml TNF KO WT M-TNF 0 1 2 3 4 5 M-TNF WT TNF KO TNF, ng/ml клетки брюшной полости нейтрофилы сыворотка wt M-ФНО wt TNFD mTNF wt M-ФНО GAPDH селезенка печень Костный мозг wt TNF D тимус PEC M-ФНО ФНО КОО wt ФНО KO M-ФНО CD11b+ Gr1high wt TNFD

Слайд 17

Макрофаги и нейтрофилы являются главным источником «системного» ФНО Survival, % 0 20 40 60 80 100 0 5 20 Hours 40 WT, T-TNF, B-TNF TNF KO, M-TNF 0 1 2 3 4 5 M-TNF T-TNF B-TNF WT TNF KO TNF, ng/ml Уровень ФНО в сыворотке ЛПС / D-Gal токсичность

Слайд 18

0 1 2 3 5 TNF, ng/ml medium LPS HKLM CpG BLP WT MN-TNF KO TNF KO 4 ФНО является геном-мишенью при активации многих TLR рецепторов

Слайд 19

ФНО, продуцируемый как макрофагами, так и Т лимфоцитами, является медиатором токсичности к продукту Грам-положительных бактерий, SEB

Слайд 20

Pathology score ALT activity, U/ml T-TNF KO B-TNF KO TNF KO MN-TNF KO WT WT TNF KO MN-TNF KO T-TNF KO B-TNF KO AST activity, U/ml WT TNF KO MN-TNF KO T-TNF KO B-TNF KO 1 2 3 4 5 0 1000 2000 3000 4000 0 1000 2000 3000 4000 Как T-ФНО, так и MН-TNF, являются медиаторами экспериментального аутоиммунного гепатита

Слайд 21

ФНО, производимый как макрофагами, так и T клетками, необходим для защиты от инфекции внутриклеточными патогенами B-TNF KO M-TNF KO T-TNF KO TNF KO WT 0 20 40 60 80 100 Выживаемость, % 2 4 6 8 Дни 0 10 2 4 6 8 10 M-TNF TNF KO WT B-TNF T-TNF Log CFU Листерия -модель внутриклеточного патогена Количество бактерий в печени

Слайд 22

TNF KO WT CD11b iNOS bacilli TNF induces granuloma formation and antibacterial mechanisms Granuloma- macrophages + CD4 T cells activation of macrophages expression of iNOS chemokines/more cells 2) Granuloma formation requires TNF anti-TNF or TNF KO- no granuloma BCG expressing TNF- restoration of granuloma 3) TNF is produced by macrophages and by T cells 4) Blockade of TNF leads to TB reactivation

Слайд 23

T cell TNF TNF Macrophage SEB ? IFNg ConA TNF amplification in response to polyclonal T-cell activation TNFR1

Слайд 24

Кооперация ФНО, продуцируемого В и Т лимфоцитами, в развитии и поддержании структуры лимфатических узлов CR1 B220 CD3 wt B-TNF T,B-TNF T-TNF

Слайд 25

Soluble TNF from B cells, but not from T cells (?) is critical for the maintenance of lymphoid organ structure

Слайд 26

100 75 50 25 0 0 50 200 250 300 350 Days post i.p. inoculation 3logLD50 Percentage survival B-TNF 9/11 TNF 2/7 wild type 5/5 Задержка терминальной фазы прионной болезни у B-TNF KO мышей

Слайд 27

FDC precursor in spleen FDC precursor in lymph node FDC precursor in Peyer’s patch B cell TNF T cell TNF TNFR1 Target genes TNFR1 Target genes B cell TNF TNFR1 Target genes Роль ФНО, продуцирумого B и T лимфоцитами, в развитии фолликулярных дендритных клеток во вторичных лимфоидных органах

Слайд 28

Superantigen induced shock Autoimmune hepatitis MN-TNF T-TNF deleterious beneficial TNF MN-TNF T-TNF deleterious beneficial TNF Intracellular pathogen beneficial deleterious MN-TNF T-TNF TNF LPS induced toxicity deleterious beneficial TNF Выводы: сложный баланс между защитными и разрушительными функциями ФНО in vivo. B-TNF B-TNF Lymphoid tissue maintenance, prion transmission

Слайд 29

Рекомбинантный ФНО имеет ярко выраженный противоопухолевый эффект (некроз опухолей) на модельных опухолях мышей. Опухоли, экспрессирующие ФНО, растут медленно или отторгаются. Может ли ФНО быть компонентом системы «иммунологического надзора» над возникающими опухолевыми клетками? Инактивация ФНО защищает мышей от химически –индуцированных опухолей кожи. ФНО и рак

Слайд 30

Является ли ФНО компонентом системы «иммунного надзора»? 0% 50% 100% 0 10 20 30 40 Weeks Survival p53 KO p53-TNF KO 100 80 60 40 20 0 Percent mice tumor free 0 10 20 Weeks 129/Sv x p53-/- IFNgR-/- x p53-/- IFNg/p53 TNF/p53 30

Слайд 31

Мыши, «гуманизированные» по локусу ФНО/ЛТ, - модель для изучения последствий блокировки ФНО Cosmid 031A LTb TNF LTa LST1 (humTNF/LT)Tg (musTNF/LT)WT/D (musTNF/LT)D/D human TNF/LT mouse TNF/LT + + + - - + - - Assessment of immune and host defense responses Pathological examination

Слайд 32

Production of human and mouse TNF by different lines of Hu-TNF/LT Tg KO mice in vivo B (A and B). TNF levels in sera after ip injection of 100 mcg LPS. (C). Mice survival after ip injection of 10 mg LPS+20mg D-GalN. C A

Слайд 33

Human TNF/LT transgene rectifies the response to a non-replicating TD antigen, SRBC, and renders transgenic mice completely protected against M. tuberculosis Body weight 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 1010 CFU/lung

Слайд 34

Inducible TNF blockade, both genetic and pharmacologic, protects mice from acute LPS/D-Gal toxicity 0 20 40 60 80 100 i-TNF WT i-TNF + polyIC WT + polyIC WT+ Enbrel WT + remicade TNF KO Remicade – mouse antibody to human TNF (2 mg/mouse) Enbrel - soluble human TNFR2-Ig (1 mg/mouse) i-TNF+polyIC – inducible deletion of TNF gene using LoxP/Cre technology 0/5 survival, % 0/8 6/6 0/8 0/4 4/4 5/5 LPS / D-Gal toxicity 50 mcg LPS + 20 mg D-Gal/mouse 20 min later i.v. or i.p. injection of TNF blockers