'

Что можно делать с одиночной последовательностью ДНК?

Понравилась презентация – покажи это...





Слайд 0

Что можно делать с одиночной последовательностью ДНК? Как исключить векторные фланки? Рестрикционная карта Вашей последовательности Дизайн праймеров Анализ ДНК-состава Повторы в ДНК Как искать гены? (прокариоты, эукариоты) Тривиальные случаи применения сборки фрагментов


Слайд 1

Как выявить векторные сегменты в Вашей последовательности? Просто сравнить с исходным вектором? VecScreen: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen_docs.html “VecScreen is a system for quickly identifying segments of a nucleic acid sequence that may be of vector origin. NCBI developed VecScreen to minimize the incidence and impact of vector contamination in public sequence databases. GenBank Annotation Staff use VecScreen to verify that sequences submitted for inclusion in the database are free from contaminating vector sequence. Any sequence can be screened for vector contamination using the VecScreen Web site”


Слайд 2

Как это выглядит?


Слайд 3

VecScreen - output “Non-significant similarity found” – ok! В нашем случае:


Слайд 4

Как интерпретировать результаты VecScreen? Если сегменты гомологии с векторов по краям – просто удалить их Если в нескольких местах по всей длине – проще всего… все это выбросить (!) Не надо выбрасывать, если: Вектор не ваш – он может быть просто родственным (100% сходство!) Ваш ген мог быть основой для вектора Но: если Вы видите неожиданную гомологию к E.coli или дрожжам – задумайтесь!


Слайд 5

Почему надо бояться загрязнения ДНК чужеродными сегментами? Быть уверенным в том, что Вы анализируете (и не тратить время зря) Ошибки распространяются по базам данных с экспоненциальной скоростью: неверная информация, проблемы сборки и т.п. В Swiss-Prot даже были специальные записи (P39188 – P39195: Alu-derived белки) Будьте внимательны при работах с базами данных! (неожиданно высокая гомология к бактериям в эукариотах и т.п.)


Слайд 6

Карта рестрикционных фрагментов Еще одна возможность проверить сиквенс на идентичность с тем, что Вы ожидаете (годится, также, для длинных геномных кусков вплоть до бактериальных геномов) Все сайты рестрикции лежат в базе данных REBASE (http://rebase.neb.com/) Как предсказать список рестрикционных фрагментов?


Слайд 7

REBASE


Слайд 8

RestrictionMapper


Слайд 9

Output


Слайд 10

Дизайн праймеров для PCR http://biotools.umassmed.edu/


Слайд 11

Primer3 Output – простой текстовый формат, предлагает четыре варианта пар праймеров, первый из которых размечен на последовательности


Слайд 12

Что можно варьировать? Искать только левый или правый праймер, или пробу для гибридизации Предлагать свой собственный левый или правый праймер Выбрать последовательность, которую Вы хотите включить или наоборот исключить из амплифицированного фрагмента Выбрать диапазон длины фрагмента Выбрать диапазон размера олигонуклеотидов, GC-состав, точку плавления …


Слайд 13

Анализ ДНК-состава G+C – состав Статистика ди- и три- нуклеотидов (не путайте статистику тринуклеотидов и codon usage) Частота более длинных слов


Слайд 14

Зачем анализировать статистику ДНК? GC-состав: (динамика плавления) Ди- и тринуклеотиды - уникальная геномная подпись: Идентификация загрязнения вектором Свидетельство параллельного переноса Островки патогенности Классификация метагеномных контигов Выявление origin репликации Более длинные слова – регуляторные сигналы


Слайд 15

Как это делать? Это самые элементарные программы – обычно установлены на компьютере EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite) – бесплатный пакет (~ 100 модулей, только под Unix) Web: http://www.genomatix.de/cgi-bin/tools/tools.pl http://bioweb.pasteur.fr/intro-uk.html Осмысленно смотреть “скользящим окном”


Слайд 16

Какие программы выбрать?


Слайд 17

Как искать повторы в ДНК? Внутренние повторы – сегменты, встречающиеся чаще, чем ожидается Могут быть несовершенными – отличаться одной или несколькими буквами Что лучше – 5 точных букв, 9 из 10 или 111 из 145? Разные score. Какой выбрать порог? => Много программ и несопоставимые результаты. Нельзя верить отрицательным результатам


Слайд 18

Dot-Plot approach http://arbl.cvmbs.colostate.edu/ molkit/


Слайд 19

Как оценить сколько одинаковых слов много, а сколько нет Статистическая модель – следует вероятность слова Самый простой расчет: CTGA - 10 раз в последовательности длины 5000. Оценим вероятность: в каждой позиции - ?*?*?*? = 1/256. Всего должно быть – 5000*1/256 ~ 20 раз Если от ожидания отличается меньше, чем в 2 раза – все нормально. То есть от 10 до 40 раз - ок


Слайд 20

Геном-специфические повторы: RepeatMasker http://www.repeatmasker.org/cgi-bin/WEBRepeatMasker


Слайд 21

Поиск (белок-кодирующих) генов Прокариоты – просто поиск длинных открытых рамок считывания (ORF) (> 100 aa) ORFing – например, ORF finder на сайте NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/gorf.html


Слайд 22

Output Открытые рамки сортированы по длине Графическое представление – ссылка на белковую последовательность, соответствующую ORF Можно сразу запустить бласт этой последовательности по разным подмножествам GenBank Если надо найти CDS в эукариотической мРНК – абсолютно аналогично


Слайд 23

Более точное предсказание –GeneMark (HMM) http://opal.biology.gatech.edu/ GeneMark/ Использует Hidden Markov Models Более короткие рамки Выбор из нескольких перекрывающихся рамок Более точное предсказание старта


Слайд 24

Heuristic Model input window Если Вы знаете геном, то лучше выбрать не Heuristic Model и указать организм


Слайд 25

Output Графический формат – посмотреть дома!


Слайд 26

Предсказание внутренних экзонов (позвоночные) Принцип: ищут те участки, которые статистически похожи на белок-кодирующие сегменты (codon usage, статистика ДНК) Выбирают только те из них, которые фланкированы подходящими последовательностями (splicing sites) То есть (!), ищут только внутренние, белок-кодирующие экзоны


Слайд 27

MZEF http://rulai.cshl.edu/tools/genefinder/human.htm


Слайд 28

MZEF - output Результат работы программы на сегменте генома человека ~2 Kbp, включающем 2 полных экзона и экзон на границе сегмента Типичный выход – ~1/2


Слайд 29

Поиск генов: GenomeScan На основе HMM (учитывает статистику ДНК) и динамического программирования Разные объекты предсказывают разные модули Использует белковую гомология http://genes.mit.edu/ genomescan.html


Слайд 30

GenomeScan - output


Слайд 31

Сборка геномных фрагментов в контиги: EGassembler http://egassembler.hgc.jp/ Чистит последовательности Маскирует повторы Маскирует векторные сегменты Маскирует сегменты геномов органелл Собирает контиги


Слайд 32

EGassembler - output


Слайд 33

Поиски регуляторных сигналов Пока поиск слишком несовершенен Самые лучшие программы не доступны on-line Результаты программ должен курировать специалист Почти все подходы используют Positional Weight Matrix (PWM)


Слайд 34

Positional weight matrix (PWM) I = ?j ?b f(b,j)[log f(b,j) / p(b)] Information content


×

HTML:





Ссылка: