'

ДНК-идентификация животных Экспертное исследование ДНК нечеловеческого происхождения

Понравилась презентация – покажи это...





Слайд 0

ДНК-идентификация животных Экспертное исследование ДНК нечеловеческого происхождения Орехов В.А. ООО “ГОРДИЗ” 31 января 2013 г. г. Звенигород


Слайд 1

«Нечеловеческая» ДНК в экспертной практике Применяется с середины 90-х годов. В последнее время повышенный интерес, публикации, монографии: - Типирование нечеловеческой ДНК (Coyle, 2008) - Судебная микробиология (Budowle, 2011) - Рекомендации ISFG (2011)


Слайд 2

Домашние животные: свидетели, нарушители, жертвы Россия занимает 2 место в мире после США по числу домашних животных на душу населения: 33% семей содержат кошек (25-30 млн. кошек), 20% семей содержат собак (20 млн. собак). При проникновении в помещение с домашним животным неизбежна «контаминация» шерстью (D’Andrea, 1998) -> возможность привязки к месту преступления либо хозяину животного (мтДНК, реже STR). Животные-нарушители: нападения на людей -> доказательство виновности или невиновности (Австралия: 4 миллиона собак, ~ 100 000 нападений на людей, большинство не раскрыто) Животные-жертвы: случаи жестокого обращения с животными


Слайд 3

Домашние животные: собаки Охарактеризовано > 30 кандидатных STR-маркеров (три-, тетра-, пента- гекса-, Tom 2010; Berger, 2008; van Asch 2008). Опубликованы мультиплексы: DogFiler – 16 локусов (Wictum, 2013) Mini-DogFiler 3 мультиплекса с мини STR(Kun, 2013) Работают на волках, лисах, койотах Иерусалим - c 2012 база данных Генотипирование экскрементов Штраф > 100 USD Премия – упаковка корма Ранее в Петах-Тикве.


Слайд 4

Домашние животные: кошки Охарактеризовано 49 кандидатных STR-маркеров (Menotti-Raymond, 1999, 2005) Предложена стандартная панель из 11 локусов. Реализовано – MeowPlex (Butler, 2002). MewPlex: 11 STR + SRY PD = 5,5 X 107 - 3,3 X 1013


Слайд 5

Судебная ботаника Связь с подозреваемого или жертвы с местом преступления через следы растений. Возможно при условии уникального видового состава растительности. 1993 год – два семени дерева Parkinsonia aculeata с места преступления в багажнике пикапа подозреваемого – доказательство вины. (Yoon, 1993) 2. Географическое происхождение наркотиков (марихуана) Возможность отследить связь пользователя с дилером и производителем. Типирование высокополиморфных STR-маркеров позволяет различить даже инбредные линии. Возможен анализ смесей. (Hsieh, 2003). Возможно создание базы данных.


Слайд 6

Судебная ботаника 15 STR multiplex PCR - Cannabis species Австралия, база данных (Howard, 2008) Шалфей предсказателей Salvia divinorum


Слайд 7

Судебная микробиология и энтомология Идентификация биологических следов. Бактерии Lactobacillus crispatus и Lactobacillus gasseri специфичны для вагинальных секретов– возможность идентификации вагинальных выделений. Менструальное происхождение крови. Streptococcus – обнаруживаются только в ротовой полости человека – слюна, отличить кровь из ротовой полости от другой крови (Donaldson, 2010) Видовой состав бактерий и грибов почвы, найденной на одежде или обуви может дать привязку к конкретной местности. Биотероризм. Октябрь 2001 –атака на правительственные учреждения США. 22 почтовых конверта с сибирской язвой -> 5 человек погибло. 125 000 конвертов были протестированы на отсутствие сибирской язвы. ФБР – рабочая гурппа по судебной микробиологии (Budowle) Личинки насекомых Diptera – привязка трупа к месту преступления. Определение давности трупа по стадии развития личинок.


Слайд 8

Анализ видовой принадлежности животных Идентификация останков неизвестного происхождения (фрагменты костей). Человек или животное? Незаконная торговля редкими и исчизающими видами (годовой оборот 20 млрд.$ в год). Агрессия диких животных (нападение на людей, домашних животных). Случаи незаконной охоты на диких животных.


Слайд 9

Этапы анализа видовой принадлежности Секвенирование участка мтДНК мтДНК - Контрольный регион – не пригоден, высокая внутривидовая изменчивость мтДНК ген Цитохрома b - наиболее удобен для идентификации видов позвоночных (Parson, 2000), позволяет дискриминировать даже близкие виды мтДНК – ген 12S рРНК – слишком консервативен. Информативно ~150 bp мтДНК – ген COI – консервативен, выбран проектом Barcode of life 648 bp 2. Анализ последовательности мтДНК: - Сравнение с референсными образцами; - Поиск гомологии в GeneBank; - Сравнение с референсной базой данных (Barcode of life)


Слайд 10

Сравнение с референсными образцами Рекомендация ISFG – параллельно с исследуемыми образцами анализировать референсные образцы из надежного источника. Последовательности выравниваются Проводится филогенетический анализ


Слайд 11

Поиск гомологии в GeneBank Последовательности загружаются в Blast: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Поиск максимальной гомологии в базе GeneBank GeneBank - Нереферируемая база данных, может содержать ошибки


Слайд 12

Nakamura et al. Int J Legal Med (2009) 123:177–184 Фрагментрый анализ мтДНК определение видовой принадлежности Мишень: участок контрольного региона мтДНК –> высокий межвидовой полиморфизм по длине. Высокая чувствительность. Универсальный набор для всех млекопитающих. Применение: анализ неопознанных останков, преступления против дикой природы, смешанные образцы


Слайд 13

Сравнение с референсной базой BOLD 3. Автоматизированный анализ в специализированных базах данных. BOLD - Barcode Of Life Database - http://www.boldsystems.org/ Задача проекта – создание наиболее полного каталога всех видов планеты. Используется участок 648 bp гена COI. Собрано видов (2012): животных: 114 098 растений: 39 730 грибов и др. 2 366


Слайд 14

Идентификация лососевых – микросателлитные маркеры 8 тетрануклеотидных маркеров для идентификации 10 видов лососевых Животовский Л.А., Шайхаев Е.Г., Шитова М.В. 2013, Биология моря


Слайд 15

OMM1050 – идентификация гибридов лососевых Гибриды кеты и горбуши (Курильский ЛРЗ, 2011г.) Горбуша Кета Гибриды Кижуч М - Маркер молекулярной массы 1, 2 – Горбуша , 139 п.н. 3, 4 – Кета, 155 п.н. 5, 6 – Гибрид горбуши и кеты, 139, 155 п.н. 7, 8 – Кижуч, 160,164 п.н.


Слайд 16

ДНК- идентификация животных Методы, используемые для анализа ДНК человека: Оптимальная схема анализа: 1) Определение видовой принадлежности с помощью секвенирования мтДНК 2) Идентификация особи с использованием STR-маркеров. Если нет информации о последовательностях – секвенирование мтДНК.


Слайд 17

Случай незаконной охоты на диких животных Дело по факту незаконной охоты на диких животных (п. а ч.1 ст. 258 УК РФ): 326 образцов: 283 образца мышечной ткани; 4 образца волос с луковицами; 3 образца шкур (один лось, два бурых медведя); 36 образцов, собранных с вещественных доказательств (перчатки, топор, смывы с вездехода и т.д.) Задача: Определить видовую принадлежность образцов, изъятых при осмотрах мест происшествий; Определить количество особей, которым принадлежат изъятые образцы; Сравнить генотипы особей с генотипами на вещественных доказательствах Работа проводилась совместно с ООО «Центр Молекулярной Генетики», МГНЦ РАМН


Слайд 18

Стратегия исследования и выбор маркеров Контрольные референсные образцы в соответствии с рекомендациями ISFG: 10 образцов бурого медведя (Ursus arctos) 10 образцов лося (Alces alces) предоставлены Институтом проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН Определение видовой принадлежности: анализ нуклеотидной последовательности участка гена цитохрома b мтДНК позиции 1 - 402 п.н.; филогенетический анализ полученных последовательностей с привлечением референсных образцов; поиск гомологии в GeneBank для образцов, не кластеризующихся с референсными образцами.


Слайд 19

Результаты анализа видовой принадлежности При анализе нуклеотидных последовательностей гена цитохрома b выявлены гаплотипы следующих видов: лось (Alces alces) - 274 образца ; бурый медведь (Ursus arctos) - 18 образцов; - дикий кабан или домашняя свинья (Sus scrofa) - 1 образец ; корова (Bos taurus) – 3 образца; человек (Homo sapiens) – 6 образцов Сиквенс Выравнивание Дерево В кластерах с референсными образцами Определялись через Blast


Слайд 20

Sus scrofa дикий кабан или домашняя свинья - Один вид (Sus scrofa); - Неразличимы на основе нуклеотидных последовательностей мтДНК гена цитохром b;


Слайд 21

Animaltype Pig – 11 STR + маркер пола


Слайд 22

Бурый медведь (Ursus arctos) выбор маркеров Нуклеотидная последовательность генома неизвестна. Описаны только динуклеотидные маркеры. Создан мультиплекс из 7 маркеров: Andreassen et al., 2012, 13 динуклеотидных маркеров


Слайд 23

Лось (Alces alces) - выбор маркеров Полиморфизм вида Alces alces в России исследован слабо. Обычно адаптируются маркеры, описанные для коровы Bos taurus (разные семейства) -> низкополиморфные маркеры. Создан мультиплекс: 4 высокополиморфных динуклеотидных STR-маркера и маркер пола, Cervid 1 оказался мономорфным


Слайд 24

Результаты STR-типирования Бурый медведь (Ursus arctos) - 10 разных генотипов в 10 референсных образцах: мультиплекс пригоден для идентификации; в исследованных 18 образцах выявлено 2 генотипа (т.е. минимум 2 особи); в связи с отсутствием популяционных данных невозможно оценить вероятность случайного совпадения. лось (Alces alces) - 10 разных генотипов в 10 референсных образцах: мультиплекс пригоден для идентификации; в исследованных 268 образцах выявлено 9 генотипов (т.е. минимум 9 особей); в связи с отсутствием популяционных данных невозможно оценить вероятность случайного совпадения.


Слайд 25

Спасибо за внимание! Владимир Орехов ООО “ГОРДИЗ” orekhov@gordiz.ru моб: +7 (495) 799-38-72 офис: +7(495) 988-02-94 www.gordiz.ru


×

HTML:





Ссылка: